miRNA-132通过靶向调控Bmi-1表达影响鼻咽癌细胞对放射治疗敏感性

作者单位：529031 江门，广东省江门市中心医院 中山大学附属江门医院肿瘤科(谭洁媚，李明毅)；510000 广州，中山大学肿瘤防治中心内科(梁颖)

miRNA-132通过靶向调控Bmi-1表达影响鼻咽癌细胞对放射治疗敏感性

谭洁媚李明毅梁颖

【摘要】目的研究miRNA-132对鼻咽癌细胞放射治疗敏感性的影响。方法使用miRNA芯片技术，对比5-8F(亲代细胞)和5-8F/R(放射治疗抵抗细胞)中miRNA表达水平差异，从中挑选差异最为明显的miRNA-132作后续研究。使用流式细胞仪检测miRNA-132对细胞凋亡的影响。使用双荧光报告素酶、蛋白免疫印迹法等方式验证miRNA-132的下游靶基因。结果miRNA-132可以促进鼻咽癌5-8F/R细胞的凋亡，提高其对放射治疗的敏感性，还可以抑制其体内的生长能力。miRNA-132可以抑制Bmi-1信使RNA和蛋白质表达水平。结论miRNA-132可通过抑制下游靶基因Bmi-1来发挥其放射治疗增敏功能。

【关键词】miRNA-132；Bmi-1；鼻咽癌；放射治疗增敏

DOI:10.3969/g.issn.0253-9802.2015.07.003

Abstract【】ObjectiveTo investigate the effect of miRNA-132 on the sensitivity of nasopharyngeal carcinoma (NPC) cells to radiotherapy. MethodsThe expression levels of miRNAs were compared between 5-8F parental cells and 5-8F/R radioresistant cells using a miRNA array; miRNA-132, which showed the most prominent changes between the two cell lines, was chosen for further study. The effect of miRNA-132 on apoptosis was examined using flow cytometry. A dual-luciferase reporter assay and western blotting were employed for the identification and verification of the downstream targets of miRNA-132. ResultsmiRNA-132 promoted apoptosis, enhanced radiosensitivity in 5-8F/R cells and inhibited the in vivo growth of 5-8F/R cells. In addition, miRNA-132 suppressed Bmi-1 expression at both the mRNA and protein levels. ConclusionmiRNA-132 enhanced the radiosensitivity of NPC cells via negative regulation of its downstream target Bmi-1.

收稿日期：(2015-01-06)

miRNA-132 affects the sensitivity of nasopharyngeal carcinoma cells to radiotherapy via targeted regulation of Bmi-1 expressionTanJiemei，LiMingyi,LiangYing.DepartmentofOncology,JiangmenHospitalofSunYat-senUniversity,Jiangmen529031,China

【Key words】miRNA-132；Bmi-1；Nasopharyngeal carcinoma；Radiosensitization

鼻咽癌是中国南方最主要的恶性肿瘤之一。目前，放射治疗是鼻咽癌公认的治疗首选方式，但约55%的鼻咽癌在放射治疗后5年内出现复发转移，导致治疗失败[1-2]。导致鼻咽癌对放射治疗产生抵抗的原因很多，主要有癌基因的异常表达，肿瘤微环境的异质性，相关信号通路的异常等[3-5]。近年来，越来越多的证据表明，miRNA不仅参与了正常组织的分化、发育，还参与了肿瘤的发生和进展。同时，miRNA的异常表达还与肿瘤细胞对放射治疗、化学治疗产生抵抗密切相关[6-7]。有文献表明，miRNA的异常表达常导致鼻咽癌对放射治疗产生抵抗，这也是鼻咽癌患者复发的重要原因[8-10]。 本研究拟探索miRNA-132对鼻咽癌细胞放射治疗敏感性的影响及其分子机制。

材料与方法

一、耐放射治疗细胞株的构建以及细胞培养

选取X射线对原代鼻咽癌细胞株5-8F进行间歇性大剂量射线照射(每次4 Gy,共15次,总量60 Gy)，每次照射后的细胞继续培养，待3～4周存活的细胞进入指数生长期后进行下一次照射，整个照射及培养过程历时6个月。培养所得的放射治疗抗性细胞分别命名为5-8F/R。所有细胞株皆使用含10% 胎牛血清的1640培养基培养。

二、实时荧光定量PCR及蛋白免疫印迹法试验

提取细胞RNA使用Trizol试剂法(Invitrogen公司)。miRNA-132的逆转录以及实时荧光定量PCR的试剂盒(qSYBR-green-containing PCR kit)均购自上海吉凯。提取细胞蛋白质后，使用蛋白免疫印迹法检测相关蛋白在细胞中的表达水平。Bmi-1以及GAPDH抗体购自Santa Cruz公司。二抗购自中杉金桥。ECL显色发光试剂盒购自康维世纪。

三、细胞凋亡试验

检测细胞凋亡试剂盒(FITC-PI双染色)购自凯基公司。细胞染色后，使用流式细胞仪检测相关凋亡情况。

四、miRNA-132转染细胞以及荧光素报告酶分析

miRNA-132 mimics以及miRNA control均购自广州锐博公司。转染试剂lipofectamine2000购自Gibco公司。使用PCR把Bmi-1的全长3′-UTR扩增之后，将其克隆入pGL3载体(Promega公司)中荧光素基因的下游。这个载体命名为wt-3′-UTR(野生型3′-UTR)。使用Quick change site-directed mutagenesis kit(Stratagene, Cedar Creek, USA)试剂盒对Bmi-1与miRNA-132的结合区域进行突变，突变后的3′-UTR克隆入pGL3载体，将载体命名为mt-3′-UTR(突变型3′-UTR)。将miRNA-132 mimics，miRNA control和wt-3′-UTR、mt-3′-UTR分别转染细胞，转染48 h后使用双荧光素酶报告系统测量荧光素值。

五、 裸鼠皮下成瘤实验

将裸鼠随机分成4组，每组5只。将1×106个细胞接种于裸鼠皮下，接种后5 d，按以下方式处理：第1组为空白对照组，第2组为单纯放射治疗组，第3组为miRNA-132过表达组，第4组为放射治疗+miRNA-132过表达组。肿瘤体积每3 d监测1次。肿瘤体积使用V=π/6(高度×长度×宽度)公式计算。

六、统计学处理

结果

一、miRNA-132在放射治疗抗性的鼻咽癌细胞株中表达水平下降

首先，我们通过miRNA芯片技术，对比了亲代以及放射治疗抵抗细胞株中miRNA表达水平的差异。芯片结果提示，较亲代细胞相比，5-8F/R细胞株放射治疗抗性细胞中miRNA-132的表达水平显著降低(图1A)。实时定量PCR实验进一步验证了miRNA芯片的结果(图1B,t=6.8,P<0.05)。

图1　放射治疗抵抗细胞株中miRNA表达水平差异

A： 5-8F/R和5-8F细胞株中部分miRNA表达水平差异；B：q-RTPCR验证5-8F/R与5-8F细胞中 miRNA-132表达水平差异;*P<0.05

二、过表达miRNA-132后可提高鼻咽癌细胞株对放射治疗的敏感性

我们使用miRNA control以及miRNA-132 mimics分别转染5-8F/R细胞株，然后对比转染前后细胞对放射治疗敏感程度的差异。凋亡试验结果提示，3种处理组之间差异具有统计学意义(F=18.36，P<0.05)。对2组之间差异分析发现，过表达miRNA-132可以促进5-8F/R细胞的凋亡(图2A,t=9.38,P<0.05)。MTT试验结果表明，和miRNA control(空白对照组)相比，转染miRNA-132 mimics之后，5-8F/R细胞对放射治疗的敏感性提高了(图2B，t=11.28,P<0.05)。

图2过表达miRNA-132后5-8F/R细胞凋亡率及对放射治疗敏感性的变化

A：3种不同处理方式之间，5-8F/R细胞的凋亡率差异；B：3种不同处理方式之间，5-8F/R细胞对放射治疗的敏感性差异

三、miRNA-132靶向调控Bmi-1的表达水平

使用Targetscan、miRNAanda等预测软件，我们发现Bmi-1可能是miRNA-132的靶基因之一。Bmi-1mRNA 3′端非翻译区(3′-UTR)包含有与miRNA-132种子区域互补配对的位点(图3A)。为了确认Bmi-1是miRNA-132直接靶标，我们将Bmi-1的全长3′-UTR克隆入荧光素酶报告载体上面。然后用miRNA-132 mimics和含Bmi-1全长3′-UTR的质粒载体共同转染5-8F/R细胞。结果表明，与空白对照组相比，miRNA-132可以抑制Bmi-1的荧光素活性(图3B，t=8.93,P<0.05)。实时定量PCR结果显示，与空载对照组相比，过表达miRNA -132后，Bmi-1的mRNA表达水平显著下降(图3C，t=10.93,P<0.05)。蛋白免疫印迹结果显示，过表达miRNA-132可使Bmi-1的蛋白表达水平下降(图3D)。

四、裸鼠体内试验验证miRNA-132放射治疗增敏作用

最后，我们使用裸鼠体内实验来进一步验证miRNA-132的放射治疗增敏作用。通过对比4种处理方式之间成瘤能力的差异，我们发现，4组不同处理方式之间存在统计学差异(图4A、B，χ2=9.87,P<0.05)。进一步对不同处理组之间比较发现，放射治疗联合miRNA-132共同作用组较空白组(t=13.56,P<0.05)、miRNA-132单独作用组(t=10.36,P<0.05)、放射治疗单独作用组(t=7.36,P<0.05)抑瘤效果更加明显。

图3　Bmi-1为miRNA-132的直接靶基因

A：miRNA-132与Bmi-1基因的3′-UTR结合位点。WT：野生型；MT：突变型；B：miRNA-132 mimics对Bmi-1野生型的荧光素酶活性的影响；C：miRNA-132对Bmi-1的mRNA表达水平的影响；D：过表达miRNA-132后抑制Bmi-1的蛋白表达水平

讨论

鼻咽癌是东南亚，尤其是中国南方常见的一种头颈部肿瘤。放射治疗是鼻咽癌常规的重要治疗方式，但是临床治疗中发现鼻咽癌患者对传统的放射、化学治疗相对不敏感，这也是鼻咽癌患者5年生存率不高的原因之一[11]。

miRNA是一类由内源基因编码的长度约为22 个核苷酸的非编码单链RNA 分子，它们在动植物中参与转录后基因表达调控。而近期的研究表明，miRNA可参与肿瘤的发生、发展，并且调控着肿瘤细胞对放射治疗、化学治疗等治疗方式的敏感性。miRNA-132普遍被认为是一个可以抑制肿瘤进展的miRNA。在胰腺癌里面，miRNA-132的启动子发生甲基化，使其表达水平下降。而过表达miRNA-132之后，可以抑制胰腺癌细胞的侵袭水平[12]。在乳腺癌组织和细胞株中，miRNA-132的表达水平普遍下降。通过恢复其表达水平之后可以抑制乳腺癌细胞的增殖、迁徙和侵袭的能力[13]。在本研究中，我们通过对比亲代和放射治疗抵抗的鼻咽癌细胞株，发现在放射治疗抵抗的鼻咽癌细胞株中，miRNA-132的表达水平是下降的。过表达miRNA-132之后，可以提高放射治疗抵抗细胞对放射治疗的敏感性。

图4放射治疗与miRNA-132联合

作用明显缩小肿瘤体积及生长速度

A：不同处理组之间，裸鼠皮下肿瘤生长体积的大小差异；B：不同处理组之间，裸鼠皮下肿瘤生长速度的差异

对miRNA-132放射治疗增敏的分子机制进一步分析之后，发现miRNA-132是通过调控Bmi-1表达水平来发挥其生物学功能的。Bmi-1基因是PcG家族中的核心成员之一，对胚胎期哺乳动物骨骼、造血及神经的发育发挥重要作用。在肿瘤细胞中，Bmi-1呈高度表达状态，其表达水平与肿瘤的发生、发展、侵袭、预后等病理指标相关[14]。而近期研究表明，Bmi-1与放射治疗抗性密切相关。例如，Bmi-1可诱导乳腺癌细胞MCF-7发生放射治疗抵抗性[15]。而在鼻咽癌细胞中，敲除Bmi-1之后，鼻咽癌细胞可恢复对放射治疗的敏感性[16]。这些研究都充分表明，Bmi-1介导了肿瘤细胞的放射治疗抵抗性。本研究通过双荧光素酶报告分析、蛋白免疫印迹法等实验方法，从多个层面验证了Bmi-1是miRNA-132的下游靶基因。过表达miRNA-132之后，可抑制Bmi-1的表达，从而发挥其放射治疗增敏的作用。

综上所述， miRNA-132调控鼻咽癌细胞对放射治疗的敏感性。当然，miRNA调控肿瘤细胞放射治疗敏感性的分子机理是较为复杂的，需进一步的研究。

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(本文编辑：杨江瑜)

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