抑制法尼基焦磷酸合成酶改善2型糖尿病大鼠左心室重构与心脏功能

杜常青++刘小伟++曾广忠++金红峰++黄敬桓++唐礼江

[摘要] 目的探讨抑制法尼基焦磷酸合成酶对改善2型糖尿病大鼠左心室重构与心功能的影响。方法采用高脂高糖饮食加一次性腹腔注射小剂量链脲佐菌素（STZ 30mg/kg）建立2型糖尿病模型。健康雄性SD大鼠30只随机分成正常对照组（control组，n=10）、糖尿病组（DM组，n=10）、糖尿病+伊班膦酸钠组（DM+IB组，n=10）。建模成功后DM+IB组SD大鼠连续16周每天皮下注射5微克，千克剂量伊班膦酸钠溶液，control和DM组大鼠在相同位置注射相等剂量的0.9%氯化钠注射液。实验21周后分别对3组SD大鼠行心脏超声和血流动力学测定，HE染色观察心肌细胞形态横截面大小，Masson复合染色检测心肌组织胶原纤维沉积程度。结果与对照组相比，DM组大鼠左心室内径增大、室间隔及左心室后壁显著增厚、心功能降低、心肌细胞明显肥大、心肌间质及心肌血管周围胶原纤维沉积显著增多（P<0.01）； DM+IB组大鼠虽出现上述结构及功能改变，但与DM组相比上述情况均有明显改善（P<0.05）。结论抑制法尼基焦磷酸合成酶在一定程度上可改善糖尿病心肌病大鼠左室重构与心脏功能。

[关键词]糖尿病心肌病；法尼基焦磷酸合成酶；伊班膦酸钠；左心室重构

中图分类号：R587.1； R445.1 文献标识码：A

文章编号：1009-816X（2015）03-0183-05

糖尿病心肌病（Diabetic Cardiomyopathy，DCM）是糖尿病最常见的并发症之一，其病理表现为心肌细胞肥大，细胞外基质（Extracellularmatrix，ECM）沉积和心肌间质纤维化。法尼基焦磷酸合成酶（Farnesyl Py- rophosphate Synthase，，FPPS是甲羟戊酸途径关键酶之一。现有研究表明，FPPS在心脏重构中扮演着重要作用，FPPS在自发性高血压大鼠（Spontaneously Hyper- tensive Rats' SHR）心脏组织中和血管紧张素II（An- giotensin Ⅱ，Ang Ⅱ）刺激的心肌细胞中表达显著升高；抑制FPPS可明显抑制Ang Ⅱ诱导的心肌肥大，改善SHR心肌肥厚、心肌纤维化。此外，心脏特异性过表达FPPS的转基因小鼠出现心肌肥厚、心力衰竭、纤维化，为FPPS参与心肌重构提供更加直接的证据。本文采用伊班膦酸钠溶液皮下注射对糖尿病心肌病大鼠模型进行干预，探讨抑制法尼基焦磷酸合成酶是否可改善糖尿病心肌病大鼠左心室重构与心功能障碍，为探索糖尿病心肌病治疗提供新的分子靶点。

1 材料和方法

1.1 实验材料：

1.1.1 实验动物：6周龄雄性（SD）大鼠30只，清洁级，体重（120±20）g左右，购自浙江省医学科学院动物中心[动物合格证号：SCXK（浙）2008-0033]。12/12小时人工昼夜交替，所有SD大鼠均自由觅食和饮水，鼠房温度18～20℃，湿度40%～60%。

1.1.2 实验试剂与药品：链脲佐菌素（Streptozotocin，STZ）、伊班膦酸钠，购自美国Sigma公司；普通饲料（20%粗蛋白、4%粗脂肪、5%粗纤维、其他71%）、高脂饲料（10%猪油、10%蔗糖、2.5%胆固醇、1.0%胆酸钠、76.5%普通饲料）由浙江省医学科学院提供；10%水合氯醛、柠檬酸、柠檬酸钠等由浙江省重点实验室浙江医院老年病研究所提供。

1.1.3 实验仪器：Med-lab生物信号采集处理系统、动物血流动力学测定系统购自中国南京美易科技有限公司。安准血糖仪、血糖试纸购自三诺生物传感股份有限公司。Olympus AU5421全自动生化分析仪、RoChe Cobas e610全自动免疫发光仪均由浙江医院检验科提供。电子天平由浙江省重点实验室浙江医院老年病研究所提供。

1.2 实验方法：

1.2.1

动物分组及动物模型的建立：SD大鼠30只，随机分为三组：正常对照组10只（control组）、糖尿病组10只（DM组）、糖尿病.伊班膦酸钠组10只（DM+IB组）。control组大鼠喂以普通饲料，DM、DM +IB组大鼠喂以高脂高糖饲料；4周后行糖耐量及胰岛素耐量试验，DM与DM +IB组出现胰岛素抵抗者给予一次性腹腔注射ST230mg/kg（以O.lmmol/L、pH4.2的枸橼酸缓冲液溶解STZ并稀释至1%浓度）；同时control组给予同等剂量的枸橼酸钠缓冲液腹腔注射。72小时后尾静脉取血，测随机血糖≥16.7mmol/L，同时出现多尿、多饮、多食现象的大鼠视为糖尿病动物模型建立成功并纳入实验。建模成功后（第5周）DM +IB组SD大鼠连续16周每天于背部肩胛骨位置皮下注射5微克/千克剂量伊班膦酸钠溶液（每周称量体重1次，根据体重改变药物剂量），其它两组SD大鼠在相同位置皮下注射相等剂量的0.9%氯化钠注射液作为对照。

1.2.2 血生化及体重监测：各组SD大鼠分别于0周（实验前）、4周及21周（伊班膦酸钠干预16周）禁食不禁水12h过夜后用电子天平称量大鼠空腹体重。然后尾静脉抽取血液3～4ml装于医用生化管中，静置30分钟后分离血清，采用全自动生化分析仪测定空腹血糖（Fast Bkxd CJlucose，FBG）、总胆固醇（TotalCholesterol，TC）、甘油三酯（Triglyceride，TG）、低密度脂蛋白（Lipoprc，tein，LDL-C），全自动免疫发光仪测定空腹胰岛素（Fasting Insulin，FINS），并计算胰岛素敏感指数（Insulin Sensitivity Index，ISI）.

1.2.3 SD大鼠心脏超声测定：实验末，大鼠腹腔注射IO%水合氯醛（400mg/kg）麻醉，待大鼠进入睡眠状态时，左侧卧位，使用Philips 7500数字化超声心动图仪（探头频率10～15MHz），将15HMZ超声探头放置于心前区，二维图像取胸骨旁左心室长轴切面，待图像清晰稳定后取得M型曲线图，测得左心室舒张末期后壁厚度（LVPWd）、舒张末期室间隔厚度（IVSd）、左心室舒张末期内径（LVEDd）、左心室收缩末期内径（LVESd）；并根据LVEDd、LVESd计算左心室射血分数（LVEF）和左心室短缩率（FS）。endprint

1.2.4 大鼠血流动力学测定：待心脏超声测定完后，仰卧固定大鼠，分离右侧颈总动脉，结扎远心端，动脉夹夹闭固定近心端，用小型眼科剪剪一V型切口，将PE50导管（内径1mm）顺着动脉在主动脉瓣开放时插入左心室，固定心导管，经压力换能器连接Medlab生物信号采集处理系统，稳定I5～20分钟左右，记录血流动力学各种参数，包括左心室收缩压（Left VentricularSystolic Pressure，LVSP）、左心室舒张末压（Left Ventricu-lar En（1-diastolic Pressure，LVEDP）、左心室压力上升最快速率（Left Ventricular Pressure Maximum Rise Velocity，+dp/dt）及左心室压力下降最快速率（Left VentricularPressure Maximum Fall Velocity，-dp/dt）等参数。

1.2.5 大鼠左心室质量指数测定：心导管测定完毕，处死大鼠，将大鼠称重后取心脏，冰0.9%氯化钠注射液冲洗，滤纸吸干，剪去血管、心耳及心外膜脂肪纤维组织，沿室间隔分离左心室（包括室间隔），称重，计算心脏指数（HMI）和左心室质量指数（LVMI），HMI：全心质量/体质量（HW/BW，mg/g），LVMI=左心室质量/体质量（LVW/BW，mg/g。

1.2.6 心肌组织HE染色与Masson染色：上述实验结束后，迅速分离部分左心室心肌组织，置入4%多聚甲醛溶液中固定，石蜡包埋，制作Sum厚的石蜡切片，并行HE与Masson复合染色。HE染色在光镜下可以观察心肌细胞形态变化。Masson染色后光镜下观察心肌组织，在显微镜下随机选取5个视野观察并采集图像数据；应用Image Pro Plus图像分析软件对所采图像进行分析，测定胶原纤维染色面积与组织切片面积之比，即胶原容积分数（Collagen Vohne Frac-tion，CVF）。

1.3 统计学处理：所有数据统计学分析均采用SAS9.3（SAS Institute，CaIy，North Carolina）统计学软件完成。计量数据以（ ±s）表示，多组间均数比较采用单因素方差分析；应用析因方差分析法尼基焦磷酸合成酶抑制剂伊班膦酸钠对糖尿病心肌病左室重构与心脏功能等相关指标的影响；P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠一般情况、血糖血脂及全心质量指数、左心室重量指数变化：采用4周高脂高糖饮食造成大鼠糖脂代谢异常后给与一次性腹腔注射小剂量链脲佐菌素（STZ 30mg/kg），4周及21周时发现DM及DM+IB组FINS、IRI、血清TC、TG、LDL-C均高于对照组，差异有统计学意义（P<0.01）。伊班膦酸钠干预对DM大鼠FBG、FINS、ISI等糖代谢指标无明显影响，但能降低TC及LDL-C水平，差异有统计学意义（p<0.01），见表1、表2。DM组成模8只、死亡1只、血糖未达标准1只；DM+lB组成模7只，死亡2只、血糖未达标准1只。DM组和DM +lB组大鼠精神萎靡，毛色枯黄无光泽，鼠身多处浸满尿渍，进食量、饮水量及尿量较Control组均明显增多，活动减少。DM组HMI、LV-Ml较对照组高，DM +lB组较DM组降低，差异有统计学意义（P<0.05），见图1。DM组大鼠心重指数较control组增高，说明已成功建立DCM模型。

2.2 各组大鼠心脏超声测试结果比较：与对照组相比，糖尿病组和伊班膦酸钠治疗组IVSd、LVPWd、LVEDd、LVEDs与LVEDs均显著升高（P<0.01），F和EF均显著降低（P<0.01）；但伊班膦酸钠治疗组与糖尿病组相比，LVPWd、LVEDd和LVEDs均有显著的改善（P<0.01），而IVSd、FS和EF有明显改善（P<0.05），见表3。

2.3 各组大鼠心功能结果比较：与对照组比较，糖尿病大鼠LVDP、LVEDP及-dp/dtmax显著增高（P<0.01），+dp/dtmax显著降低（P<0.01），LVSP明显降低（P<0.05）；与对照组比较，伊班膦酸钠治疗组LVEDP和-dp/dtmax有所升高（P<0.05），+dp/dt-max有所降低（P<0.05）；但伊班膦酸钠治疗组与糖尿病大鼠组相比，LVDP、LVEDP及-dp/dtmax明显降低（P<0.05），LVSP和+dp/dtmax明显升高（P<0.05），见表4。

2.4 各组大鼠心肌组织胶原纤维染色比较：第21周末，HE染色显示，对照组大鼠心肌纤维间排列整齐、纤细，结构清楚，普遍心肌细胞束间隙变窄，间质可见少量成纤维细胞；糖尿病大鼠心肌细胞肥大、扭曲，排列紊乱，心肌纤维间排列紊乱，分布不匀，结构不清晰；伊班膦酸钠干预组大鼠较糖尿病组上述异常改变明显减轻。Masson染色结果：对照组大鼠心肌细胞间、血管周围可见少量胶原纤维，糖尿病组大鼠心肌间质和血管周围胶原纤维较对照组显著增多，伊班膦酸钠干预后纤维化程度减轻，见图2。显微镜下随机选取5个Masson染色图片视野并采集图像数据，应用Image Pro Plus图像分析软件对所采图像进行分析，测定胶原容积分数（Collagen Volume Fraction，CVF）。结果显示，糖尿病组胶原面积为（14.34±1.51）%，显著高于对照组的（3.90±0.95）%（P<0.01）。伊班膦酸钠干预组为（9.38±1.28）%显著低于糖尿病组（P<0.05）。

3 讨论

心功能不全为DCM最常见且严重的并发症，主要表现为早期以心脏舒张功能不全、晚期则以左心室收缩功能受损或全心功能不全为主，容易发展成充血性心力衰竭。本实验发现长期伊班膦酸钠干预可在一定程度上可改善糖尿病心肌病大鼠左心室重构与心脏功能障碍。

本实验研究中，采用Masson复合染色观察糖尿病大鼠左心室胶原纤维沉积情况，结果提示糖尿病大鼠左心室胶原纤维较对照大鼠明显增多，粗大的胶原纤维分布不均匀，排列极其不规则，相互连接成网状或团块状，紧紧密集地绕于心肌细胞周围及小血管周围。HE染色进一步发现糖尿病组大鼠心肌细胞肥大，炎症细胞浸润和间质纤维化明显。结合彩色超声心动图及血流动力学指标，结果显示糖尿病大鼠无论是收缩还是舒张功能都明显受损。上述实验研究结果均提示糖尿病大鼠存在明显的左心室重构，胶原纤维的大量沉积增加了心室壁的僵硬度，降低了心室顺应性，最终发展成心室舒张及收缩功能不全。endprint

给予5微克/千克剂量伊班膦酸钠皮下注射治疗16周后，Masson复合染色显示胶原纤维虽有沉积，但程度较糖尿病组明显改善；HE心肌细胞横断面染色提示伊班膦酸钠治疗后心肌细胞局灶性肥大得到了明显的改善；左心室肥厚指标如IVSd、LVPWd参数也较组大鼠减轻，此外，心肌纤维化指标如全心质量指数、左心室重量指数也较对照组下降明显。伊班膦酸钠抑制左室重构的同时带来了左心室收缩及舒张功能的改善，如左心室LVEF，LVFS，+dp/dtmax等收缩指标较糖尿病组升高，而LVEDP，-dp/dtmax等舒张指标则较糖尿病组下降。上述结果提示抑制法尼基焦磷酸合成酶改善糖尿病心肌病大鼠左心室重构与心力衰竭。

糖尿病心肌病变确切的发病机制还不清楚，涉及多种影响因素：心肌细胞代谢紊乱（如葡萄糖、游离脂肪酸代谢紊乱）、微血管病变、心肌自主神经病变、胰岛素抵抗和氧化应激反应等均促进糖尿病心肌病的发生和发展。本研究发现伊班膦酸钠干预对糖尿病大鼠FBG、FINS、ISI、TG、HDL等糖脂代谢指标无明显影响，但能降低TC及LDL-C水平（P<0.01），这与国外许多学者研究结果一致。但伊班膦酸钠是否通过降低TC与LDL-C水平从而改善心肌重构与心脏功能需要进一步研究证实。

伊班膦酸钠可改善DCM左心室肥厚、心肌间质纤维化和左室收缩、舒张功能，但其信号通路在本研究中目前尚未进一步深入研究。诸多实验证实MAPKs信号转导通路参与了心肌肥厚的发生发展。同样研究表明小GrIP蛋白参与调控心肌细胞的肥厚，及MAPKs通路的活化。FPPS作为甲羟戊酸途径关键酶之一，通过调控RhoA/ROCK/MAPKs信号转导通路，发挥其抗细胞增殖、分化及肥厚反应等生物多效性。已有研究发现利用含氮双磷酸盐（N-BPs）或慢病毒介导的siRNA-FPPS，抑制FPPS，能通过抑制RhoA/ROCK/MAPK家族磷酸化从而明显改善SHR心肌肥厚、心肌纤维化。故本实验研究中伊班膦酸钠可能通过抑制FPPS活性下调小GrIP蛋白的表达从而抑制MAPKs信号转导通路最终改善DCM大鼠左室重构与心力衰竭，但具体机制还需进一步论证。

总之，本实验研究结果显示FPPS抑制剂伊班膦酸钠可减轻DM心肌病变，延缓DCM进展，改善了心肌的病理变化，保护心功能，可能为DCM治疗提供了一种新的思路和策略。endprint