软骨细胞特殊染色技术的比较与应用

于　斐，曾　晖，于红燕，雷　鸣，袁　昊，肖德明

(1.北京大学深圳医院，深圳 广东　518036；2.滨州市滨城区市立医院，滨州 山东　256600)

软骨细胞特殊染色技术的比较与应用

于斐1，曾晖1，于红燕2，雷鸣1，袁昊1，肖德明1

(1.北京大学深圳医院，深圳 广东518036；2.滨州市滨城区市立医院，滨州 山东256600)

【摘要】目的探讨多种特殊染色技术在软骨细胞中的染色规律及其应用价值。方法选取出生7 d内的C57BL/6J小鼠12只，处死后取双侧膝关节软骨行软骨细胞原代培养，并行II型胶原免疫荧光鉴定，取5代以内的原代细胞制作细胞爬片，细胞爬片制备完成后行HE染色、番红O-固绿双染色、SA-β半染糖苷酶半乳糖苷酶衰老染色及II型胶原免疫组化染色，观察软骨细胞组织形态变化，并对几种染色方式进行比较。结果HE染色中细胞核呈紫蓝色，细胞质呈粉红色，细胞形态结构清楚；番红O-固绿双染色中细胞核呈粉红色，细胞质呈蓝绿色，细胞形态结果较清晰；SA-β半染糖苷酶半乳糖苷酶衰老染色时，衰老软骨细胞呈绿色，未衰老细胞无着色；II型胶原免疫组化染色时，II型胶原呈棕黄色，细胞核呈紫蓝色。结论HE染色和番红O-固绿双染色可以清晰分辨细胞核和细胞质等细胞结构，对单个细胞形态的显示比较清楚；SA-β半染糖苷酶半乳糖苷酶衰老染色可以显示出衰老细胞的数量及衰老的程度；II型胶原免疫组化染色可以对II型胶原进行定位与定量。

【关键词】软骨细胞，特殊染色，细胞爬片，原代细胞，膝关节

骨关节炎发病机制及治疗措施的研究中经常用到细胞学水平的研究，观察软骨细胞的形态结构成为实验中的一种重要的方法。在过去的研究中[1-3]，人们对软骨大体标本的特殊染色技术已经进行了大量的改良，并应用于骨关节炎的研究中，取得了良好的效果，但是对于软骨细胞水平的染色技术发展缓慢，以至于无法用简便的方法对细胞形态进行观察，对研究造成了不便。本研究利用C57BL/6J小鼠进行软骨细胞的原代培养，对软骨细胞爬片进行HE染色、番红O-固绿双染色、SA-β半染糖苷酶衰老染色及II型胶原免疫组化染色，探讨这几种染色技术在软骨细胞爬片中的染色规律及应用价值，为骨关节炎细胞水平研究提供便利的条件。

1材料和方法

1.1实验材料

1.1.1实验动物及实验环境: 出生7 d内的健康SPF级C57BL/6J小鼠12只【动物合格证号：No:44007200018611】，雌雄不限，体重(4±1) g，实验用小鼠够购买自广东省医学实验动物中心【生产许可证号：SCXK(粤)2013-0002；使用许可证号：zSYYX(粤)2013-0002】，饲养于北京大学/香港科技大学医学中心深圳医院实验动物中心【使用许可证号：SYXK(粤)2010-0106】SPF级屏障区域的PVC鼠笼内，持续过滤通气，自由饮食，清洁饮水，每日保持12 h光照/黑暗循环。实验流程和小鼠处理均遵循实验动物管理规范条例。

1.1.2实验仪器: 高压灭菌器(日本Hirayama公司)，用于实验材料的灭菌；电热鼓风干燥箱(中国精宏公司)，用于灭菌材料的干燥；纯水机(美国Millipore公司)，用于试剂配制；恒温水浴锅(上海百典仪器设备有限公司)，用于试剂复温；生物洁净工作台(中国苏净公司)，用于实验操作；微量移液枪(Thermo fisher)，用于试剂配制及细胞培养；高速冷冻离心机(德国Sigma公司)，用于细胞离心；培养箱(德国Themo公司)，用于细胞培养；光学显微镜(德国Leica公司)，用于细胞观察及拍照。

1.1.3实验试剂: II型胶原一抗、goat anti-rabbit IgG H&L (Cy3 ®) preadsorbed 9购自Abcam公司，生物素化兔抗山羊IgG、SABC-POD、DAB显色试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司，fast green solution、safranin O solution购自Scytek公司，细胞衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒购自碧云天公司，Collagenase、胰酶购自Worthington公司，改良型RPMI-1640培养基购自HyClone公司，青/链霉素溶液购自伊科赛公司，胎牛血清购自Life公司，0.4%台盼蓝溶液购自广州晶欣公司，二甲苯、无水乙醇、30% H2O2购自广州化学试剂厂，苏木素购自广州速聚生物有限公司，中性树胶购自国药集团化学试剂有限公司，伊红Y购自行知生物科技有限公司。

1.1.4试剂配制: 软骨细胞培养液：改良型RPMI-1640培养基 90 mL，胎牛血清 10 mL；4% II型胶原酶消化液：collagenase粉末 4 g, PBS 96 mL。

1.2实验方法

1.2.1小鼠膝关节软骨细胞的分离培养: 取出生7 d以内的C57BL/6J小鼠12只，全部实验动物气管窒息法处死，置于75%酒精中浸泡5 min，取出小鼠用碘伏消毒膝关节处；PBS漂洗3遍各3 min；将组织块剪切成 1 mm3；加入含有双抗的4% II型胶原酶中于37℃、5% CO2培养箱中消化4 h；充分吹打细胞消化液，200目过滤收集滤液；1 500 r/min离心5 min，无菌PBS清洗并离心2次；弃上清液加入6 mL完全培养基重悬细胞沉淀，接种至培养瓶中；于37℃、5% CO2培养箱中培养观察，1∶3比例传代，取3代以内的细胞进行实验。

1.2.2软骨细胞爬片的制作： 准备多聚赖氨酸溶液浸泡后的24孔板大小的盖玻片于超净台中晾干；5代以内的软骨原代细胞消化后台盼蓝计数，配制成1×105/mL细胞悬液；24孔板中加入少许培养基，将细胞悬液均匀滴到玻片上；常规培养6 h等到细胞贴壁后，再滴加培养基布满整个板底，继续培养至24 h。

1.2.3软骨细胞的鉴定： 将分离取得的细胞1×105接种到细胞爬片，静止贴壁；吸去上清培养基；孵育一抗，anti-collagen II antibody，37℃，1 h；PBS轻微洗涤3次；孵育goat anti-rabbit-Cy3，37℃ 1 h；PBS轻微洗涤3次；孵育Hoechst 33258，室温15 min。

1.2.4细胞爬片的HE染色： 4%多聚甲醛固定细胞爬片20 min，流水冲洗3次各2 min，苏木素滴染2 min, 自来水返蓝2 min，80%酒精急洗，伊红滴染30 s。

1.2.5细胞爬片的番红O-固绿双染色： 4%多聚甲醛固定细胞爬片20 min，流水冲洗2 min ×3，苏木素染核2 min，自来水返蓝2 min，番红O染液滴染30 min，95%乙醇分化10 s，自来水洗10 s，60℃预热固绿滴染1 min，蒸馏水急洗一次，番红O染液复染30 min，95% 乙醇分化5 s，自来水冲洗10 s。

1.2.6细胞爬片的SA-β-gal半乳糖苷酶衰老染色： ①染色工作液根据碧云天细胞衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒说明书配制：β-半乳糖苷酶染色液A 10 μL，β-半乳糖苷酶染色液B 10 μL，β-半乳糖苷酶染色液C 930 μL，X-Gal溶液50 μL，混合均匀。②β-半乳糖苷酶染色固定液固定30 min，PBS洗5 min ×3，染色工作液覆盖爬片37℃过夜。

1.2.7细胞爬片的II型胶原免疫组化染色： 4%多聚甲醛固定细胞爬片20 min，流水冲洗2 min ×3；烤片3 min；蒸馏水冲洗2次；抗原修复； PBS冲洗3次；滴加过氧化物酶阻断剂；PBS液冲洗3次；滴加非免疫性动物血清；滴加II型胶原一抗；PBS液冲洗3次；滴加生物素标记的二抗；滴加SP溶液；滴加2滴新鲜配制的DAB溶液。

2结果

几种特殊染色方法观察软骨细胞形态结构比较见表1。

2.1倒置显微镜下软骨细胞形态

常规消化细胞，并用含10% FBS的1640培养基培养关节软骨细胞，分别与0、3、7 d于显微镜下观察细胞形态(图1见彩插6)。0 d软骨细胞均匀分布在培养瓶底，处于待贴壁状态；3 d软骨细胞完全贴壁，呈梭形、三角形或多角形；7 d软骨细胞融合，铺满培养瓶瓶底。

2.2II型胶原免疫荧光鉴定软骨细胞

II型胶原是软骨细胞分泌的特异性胶原，可利用II型胶原的免疫荧光对软骨细胞进行鉴定。荧光标记后，软骨细胞细胞核呈圆形紫蓝色荧光，II型胶原呈条带状红色荧光(图2见彩插6)。

2.3HE染色观察软骨细胞

苏木素可与核酸等酸性物质结合显示蓝色，而伊红可与碱性蛋白物质结合显示出红色，进而将细胞的形态结构区分开来。染色后我们可以看到软骨细胞的细胞核呈蓝色，为圆形或者卵圆形，细胞质呈粉红色，三角形或梭形(图3见彩插6)。

2.4番红O-固绿双染色观察软骨细胞

番红O是碱性染料可与核酸结合显示红色，固绿是酸性染料可与蛋白结合将显示蓝色或者绿色。染色后我们可以看到细胞核呈粉红色，但部分颜色被细胞质染色所覆盖，细胞质呈蓝绿色(图4见彩插6)。

2.5SA-β-gal半乳糖苷酶衰老染色观察软骨细胞

细胞衰老后，溶酶体中β半乳糖苷酶的表达升高，表达量越高，细胞所染颜色越重，衰老程度也越严重。染色后我们能够清楚的看到细胞质绿染且颜色深浅不一，细胞核无法辨别(图5见彩插6)。

2.6II型胶原免疫组化染色观察软骨细胞

II型胶原免疫组化染色可以特异性的定位II型胶原的位置，苏木素复染后可以显示细胞核的位置。染色后我们可以看到II胶原表达出呈现棕黄色，而细胞核呈现紫色(图6见彩插6)。

表1　几种特殊染色方法观察软骨细胞形态结构比较

注：“-”为阴性，“+”为阳性且“+”至“++++”阳性程度越高，分辨越明显。

Note. “-” is negative, “+” is positive ,“+”to“++++” represent the increasing levels of positive staining and better resolution

3讨论

软骨细胞是关节软骨中唯一的细胞，被包埋在软骨基质中，它可以感受机体周围的变化，维持细胞外基质的平衡，其分泌的细胞外基质主要是糖蛋白和II型胶原[4]。软骨细胞的细胞核较小，呈圆形或卵圆形，有一到数个核仁，细胞可呈三角形、梭形或多角形。在软骨组织中，越靠近周边的软骨细胞越幼稚，常单个分布；越靠近中央的软骨细胞越成熟，常多个聚集在一起[5]。骨关节炎(OA)与关节软骨细胞的衰老和凋亡密切相关，主要表现为进行性的软骨关节破坏，本质上是一种生物学重建过程[6]。随着我国老龄化进程的加剧，该病已经成为影响老年人健康的主要慢性退行性病变之一，但是对其发病机制仍然知之甚少，因此对该病的研究成为近年来的热点。

目前对于动物标本的特殊染色技术发展较快，在骨关节炎领域的研究中应用广泛。细胞学水平的研究与动物水平的研究同等重要，但是细胞染色技术发展较慢，在骨关节炎研究领域应用较少，这一方面是因为细胞染色与组织标本相比染色困难，另一方面是由于电镜等技术的发展代替了染色对细胞结构的观察。但是，对于软骨细胞的特殊染色仍有其优点，比如操作简便、价格低廉、不需要特殊的仪器设备等，这对于没有电镜等特殊设备的实验室仍然是一个好的选择。

本课题组在进行骨关节炎的研究过程中，根据研究的需要对软骨细胞的HE染色、番红O-固绿双染色、SA-β-半乳糖苷酶衰老染色和II型胶原免疫组化染色条件进行了探究，取得了良好的效果。

苏木素-伊红染色技术是病理技术中最经典的染色方法，是由Waldeyer于1863年首先提出来的，一直沿用至今。常规的HE染色是根据苏木素和伊红两种染料对酸碱性物质的亲和性不同而着色，苏木素可与核酸等酸性物质结合，从而使细胞核呈现蓝色，而伊红可以与细胞质中的碱性蛋白物质结合，显示出红色，进而将细胞的形态结构区分开来[7]。我们可以看到，在软骨细胞爬片的HE染色中，细胞核与细胞质结构清楚，单个细胞的轮廓也清晰可辨，是一种观察细胞形态较好的染色方式。

番红O-固绿双染色中，番红O是碱性染料可与核酸结合将细胞核红染，固绿是酸性染料可与蛋白结合将细胞核染成蓝色或者绿色[8]。在软骨细胞爬片中，可以分辨出细胞核与细胞质的结构，但分辨率不如HE染色清楚，这种分辨情况与软骨组织中两种染色的分辨情况正好相反，这可能是由于固绿与番红O相比更容易着色，而绿色可以覆盖部分红色使得结构相对不太清晰。但是，该染色在软骨细胞或软骨组织中是一种特异性的染色，其使用率较高，通过我们在软骨细胞爬片上的实验也得到了预期的效果，可以在软骨细胞中加以应用。

β-半乳糖苷酶是检验细胞衰老的一种特异性的标志酶，由Dimri等[9]在1995年首次提出，衰老软骨细胞在pH 6.0时会表现出溶酶体β-半乳糖苷酶活性的升高，衰老的软骨细胞可以表达此酶，通过对不同阶段的软骨细胞的衰老染色情况进行分析，可以得到软骨细胞的衰老情况，从而确定不同状态下软骨细胞老化的速度及程度[10]。通过实验结果我们可以看到，由于β-半乳糖苷酶表达量的升高，细胞质被染成绿色，并且当细胞衰老程度越严重时，绿色越明显，而未衰老的细胞则无此染色。该染色在反应细胞的形态结构方面不清楚，无法分辨细胞核与细胞质。

II型胶原是软骨细胞分泌的特异性物质，通过II型胶原免疫组化染色可以对软骨细胞进行特异性的定位，对II型胶原的分布及定量作用明显，通过苏木素的复染，可以分辨其余细胞，作用很大。我们通过染色发现，II型胶原表达处呈现棕黄色，而通过苏木素的复染，细胞核呈紫色，从而清晰的分辨出细胞核与细胞质。由于II胶原只是细胞分泌的细胞外基质中的部分成份，该染色无法显示细胞质中的其他成份，所以单个细胞的形态不是很清楚。该染色在II型胶原特异性的定位及定量作用比较明显。

综上所述，各种染色方法各有优缺点，但在软骨细胞形态观察方面，HE染色和番红O-固绿双染色分辨细胞比较清楚，可以获得更加全面的信息，尤其以HE染色最佳；SA-β-gal半乳糖苷酶衰老染色对于衰老软骨细胞的数量及软骨细胞衰老程度的检测用处较大；II型胶原免疫组化染色则可以用于II型胶原的定位与定量。我们在使用软骨细胞进行研究时，可以综合采用多种染色方法。

参考文献：

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〔修回日期〕2015-07-12

研究报告

Comparison of different special staining techniques of

chondrocytes and their application values

YU Fei1, ZENG Hui1, YU Hong-yan2, LEI Ming1, YUAN Hao1, XIAO De-ming1

(1. Peking University Shenzhen Hospital, Guangdong Shenzhen 518036, China;

2. Municipal Hospital of Binzhou, Shandong Binzhou 256600)

【Abstract】ObjectiveTo compare the advantages and values of several special staining methods of chondrocytes.MethodsTwelve 7-day old healthy C57BL/6J mice were killed to obtain the cartilage tissue of the knee joint in order to isolate the chondrycytes. Type II collagen was used to assess the chondrocytes. Then the chondrocyte climbing slices were prepared. The materials were fixed, and HE staining, Safranin O-fast green staining, SA-β-gal staining and immunohistochemical staining of Type II collagen were performed and compared. ResultsHE staining showed clear morphology of the chondrocytes. The cell nuclei were stained blue and the cytoplasm was pink. Safranin O-fast green staining showed that the nuclei were pink and the cytoplasm green. SA-β-gal staining showed that the aging cells were green while the young cells were colorless. Immunohistochemical staining of type II collagen showed the distribution of type II collagen and they were stained brown while the cell nuclei were blue.ConclusionsHE staining and safranin O-fast green staining can provide more information than the other staining techniques. SA-β-gal staining is useful in the analysis of aging chondrocytes. Immunohistochemical of type II collagen can be used to study type II collagen.

【Key words】Chondrocytes, special staining; Cell climbing slices; Primary cells; Knee joint, mice

doi:10.3969.j.issn.1671.7856. 2015.008.012

【中图分类号】R-33

【文献标识码】A

【文章编号】1671-7856(2015) 08-0058-04

[通讯作者]肖德明 (1956-)，男，博士生导师、教授、主任医师。研究方向：骨关节炎、骨科生物材料。E-mail: xiaodm1@163.com。

[作者简介]于斐 (1989-)，男，硕士研究生。研究方向：骨关节炎、骨科生物材料。E-mail: ocarfyu@163.com。

[基金项目]国家自然科学基金面上项目(项目编号：81272032)；深圳市科工贸与信息委员会重点项目(项目编号：201101001)；深圳市科创委资助项目(项目编号：JCY20130402114702130)。