微生物利用废弃油脂合成PHA的研究进展

刘慧,任连海

(北京工商大学 食品学院,北京 100037)

微生物利用废弃油脂合成PHA的研究进展

刘慧,任连海

(北京工商大学 食品学院,北京 100037)

摘要:指出了聚羟基脂肪酸酯(PHA)是细菌在碳源充足、氮源缺乏的情况下产生的作为胞内碳源和能源储存物的生物聚酯,PHA作为一种可降解高分子材料,可替代传统塑料。然而高于传统塑料5~10倍的生产成本是限制PHA大规模应用的主要原因。以废弃油脂为碳源生产PHA,不仅能有效降低PHA成本,同时可以为废弃油脂的资源化提供合理的途径。综述了近年来废弃油脂用于PHA合成的最新进展。

关键词:聚羟基脂肪酸酯(PHA);废弃油脂;微生物合成

1引言

聚羟基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanoates,PHA)是广泛存在于微生物体内的一类高分子生物聚酯,在生物体内主要作为碳源和能量的贮藏物质,如图1所示。PHA与传统的、以石油为原料合成的塑料具有相似的材料学性质,但可以用可再生的资源合成,并且具有生物可降解性、生物相容性和不依赖化石资源等特性,可以完全降解进入自然界的生态循环,具有广阔的应用前景。因此,通过生物技术利用可再生资源生产PHA,获得生物可降解聚合物以代替源自石油的普通塑料,受到相关领域研究者的普遍关注。

图1　细胞内的PHA

2PHA研究现状

PHA在20世纪20年代就被发现,当时研究者发现其能被苏丹染料染色,可溶于氯仿[1],但未给其命名。1926年,Lemoigne[2]在巨大芽抱杆菌中,也发现了此类物质,并首次给这类物质命名。随后研究发现,很多菌株都能够合成PHA。在这一阶段,还研究了PHB的天然颗粒提取及提取的PHB的功能[3],并且对PHB合成和分解代谢[4]进行了初步研究。1974年,Wallen和Rohwedder[5]发现了其它PHA,标志PHA研究进入发展阶段。其他PHA的发现引发了人们研究PHA的兴趣,中长链PHA开始被人们广泛认识[6,7]。在以后的20多年里发现了多种各种各样、性能各异的PHA。在这一时期,PHA的商业应用研究也开始起步,第一个商业化产品3HB和3HV的异聚物也在这一时期诞生了。在各种各样的细菌中都检测到了PHA的存在。PHA合酶基因[8]的克隆标志着PHA的研究进入了迅猛发展阶段。分子生物学的发展为在分子水平研究PHA提供了可能。在这一发展阶段,研究者们主要进行的是对合成这些聚酯分子生物学手段完美的应用于PHA基因的克隆、缺失突变、嵌合研究中,提高了PHA的产量、产生了新型PHA。聚羟基脂肪酸酯作为一种可替代传统塑料的新型材料已被国内外学者广泛研究,国内的研究主要集中在利用基因修饰合成PHA[9~11],利用活性污泥合成PHA[12,13],以及PHA在微生物细胞内的生物合成途径和合成PHA的酶的研究[14]。

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3PHA的结构及应用

PHA具有多种单体,其结构是一种带有多羟基的链式聚合物,根据其支链的结构,进行不同的命名。其结构通式为如图2所示。

图2　PHA的分子结构

其中n=1、2、3或4;通常m=1。n为聚合物单体的数目,多为100~3000,决定分子量的大小。R代表侧链,可为饱和或不饱和、直链或含侧链及取代基的烷基。根据单体中的碳原子数,可将PHA分为两类:短链PHA,单体中含有3~5个碳原子;中长链PHA,单体中含有6~14个碳原子[15]。根据PHA单体成分是否唯一,也可将PHA分为均聚物和共聚物。在所有已发现的PHA中,除PHB、PHV为均聚物外,其余皆为共聚物。不同结构的PHA是在与其单体结构相关的底物培养中获得的,这使得合成多种不同结构的PHA成为可能。

自1926 年Lemoigne第一次在芽抱杆菌中发现 PHB,到目前为止,研究人员已经在300 多种细菌内发现了近百种不同脂肪酸构成的 PHA单体,这些单体涵盖了碳原子数从3到16的具有饱和或不饱和键或支链的脂肪族以及芳香族3-羟基脂肪酸[16-18],几种常见的PHA分子式见表1。

表1　PHA的单体结构

PHA具有良好的生物相容性能、生物可降解性、紫外稳定性、生物组织相容性和塑料的热加工性能、光学活性、压电性、抗潮性、低透气性等特殊性能,在日常生活、医学、农业、工业、环境保护等各个领域有着巨大的研究价值:①可降解包装材料,由于PHA是类似聚丙烯的可降解材料,因此可应用于制造可抛弃型的材料用具,如手袋,包装膜,容器等。②医药行业,PHA具有生物可降解性和生物相容性,可用作缓释材料,当其作为药物基质包埋药物植入人体后,随着药物释放,能降解为3HA,而3HA在人体中是一种正常存在物质,可被人体自行代谢,而不有任何毒副作用。PHA还可以用来生产手性单体。手性药物的天然存在性使手性药物使用起来更安全有效且使用剂量更小[19]。③组织工程,生物相容性、生物可降解性、无毒性、无刺激性、无免疫原性、不溶血及无致突变性、压电性等特点使PHA在组织工程中广泛应用。比起传统的组织工程材料,PHA的无毒可降解性使得患者在进行手术时更加安全,且能减少再次创伤、减轻患者再次疼痛。④压电性,PHB经过80℃碾压后再经热处理制成单轴定向的箔和薄膜后在45℃增加拉力或剪应力,使其呈现表面压电特性,即可应用于压力测试仪,点火器,诊听器,声学仪器等仪器。⑤生物能源,PHA作为一种聚酯本身就具有可燃性,当其经甲酯化处理PHA即得到3-羟基脂肪酸甲酯,可以直接作为生物燃料,燃烧热稍低于乙醇[20]。⑥其他应用,PHA还具有光学活性,可应用于色谱中分离手性物质。此外,PHA可在农业、环境中用作指示剂等,具有广泛应用。

4利用废弃油脂合成PHA

虽然PHA聚合物具有在自然条件下能被完全降解的优点,可作为传统塑料的替代物。但时至今日,PHA并没有得到大规模的应用。其中最主要的原因是生产PHA的成本太高。目前PHA生产主要依赖于微生物发酵,在微生物发酵合成PHA的所有发酵条件因素中,底物是一个重要因素,其成本占到总成本的28%~50%[21]。采用廉价底物将在很大程度上降低PHA的生产成本。利用废弃油脂合成PHA既可以解决废弃油脂处理不当带来的废水、废气等环境污染的问题,又可以降低PHA的生产成本,使其获得广泛应用。

4.1　生物柴油副产物

近年来,石油危机、能源紧缺的问题日益严峻,世界各国正积极研发太阳能、风能、水能、生物质能等可再生的替代能源。生物柴油作为一种极有前景的可再生能源,受到全世界学术界和产业界的普遍关注。然而,在生产生物柴油的过程中会产生大量的副产物,主要包括脂肪酸甲酯、甘油、游离脂肪酸、水、低碳醇(甲醇或乙醇)和微量的盐(如K2SO4,NaCl)等[22~23]。其中仅甘油一种产物就可达到生物柴油总产量的1/10。生物柴油副产物是非常好且便宜的PHA合成的原料。以生物柴油副产物为原料合成PHA,对于解决生物柴油副产物过度积累的问题具有重要意义,因此利用生物柴油副产物甘油合成PHA受到广泛关注。

Nikel等以甘油为碳源,利用重组大肠杆菌arcA突变株,添加1.78 g/ L水解酪氨酸合成了PHB[24]。Koller等最先利用还未被鉴定的耐高渗透压的微生物以生物柴油副产物为碳源在未添加任何前体的情况下合成P(3HB-co-3HV)[25]。Mothes等利用纯甘油,以Paracoccus denitrificans和Cupriavidus necator JMP 134为出发菌株合成PHB,PHB占细胞干重的70%。当以含有5.5% NaCl的粗甘油为碳源时,PHB含量降低至48%,这主要由于氯化钠高渗作用引起的[23]。Cavalheiro等以纯甘油为底物,利用Cpriavidus necator DSM 545生产PHB,最大细胞干重是82.5 g/L,PHB产量可达细胞干重的62%,产率为1.1~1.5g PHB L-1h-1。当以废甘油为底物时,PHB产率为0.84 gPHBL-1h-1,细胞干重为68.8g/L。生物量浓度在PHB积累时起到关键作用,降低生物量的浓度,PHB含量可达细胞干重的50%,PHB产率可达1.1gPHB L-1h-1[26]。Mazur等以Cupriiavidus necator为出发菌株,在添加了米糠油制备的生物柴油副产物的矿物盐培养基中,30℃,150rpm培养24h,合成了PHB[27]。

4.2　餐厨废油

餐厨废油包括煎炸废油、泔水油和地沟油等源自于餐饮业的废油脂,成分主要是烹调用植物油和食品中动物油脂,化学组成主要为脂肪酸甘油酯[28]。

煎炸废油是指餐馆、饭店、单位食堂等做煎炸食品后废弃的煎炸用油。煎炸废油属于大分子疏水性有机物,其在多次煎炸过程中与空气中的氧气接触,发生一系列水解、氧化、聚合等复杂反应,使得油黏度增加,油中原本含有的一些不饱和脂肪酸含量极低,产生了一些具有致癌作用的脂肪酸类聚合物及醛、酮、内酯等刺激性气味的物质。泔水油主要是指从餐厨垃圾中分离回收的废油,这类废油是植物油和动物油的混合物,主要来自餐厨垃圾处理厂,容易收集和集中管理。地沟油是从餐饮单位厨房排水除油设施分离出的油脂和排水管道或检查井清掏污物中提炼出的油脂,由于地沟油回收、加工及提炼过程卫生条件恶劣,导致地沟油中含有多种有毒有害成分,重金属、细菌、真菌、黄曲霉毒素等严重超标,因此地沟油对人体具有很大的危害性。餐厨废油如果进入环境或被不法商贩加工为食用油重新回到居民餐桌,会造成极大的环境污染,并严重威胁人类健康。同时餐厨废油具有废物与资源的二重性,由于其回收价格低,含碳量高,因此作为微生物培养的有效碳源获得了广泛的研究。

Taniguchi等研究发现,Ralstonia eutropha(现重新命名为C.necator)能吸收植物油脂废物以及废动物脂,转换成PHA,且产量较高,高达细胞干重的80%[29]。Stanislav Obruca等以废弃菜籽油为底物,利用Cpriavidus necator H16生产PHA,通过连续培养PHA产量可达105g/L,每克油脂可产生0.83gPHA,产率为1.46gPHAL-1h-1[30]。Kahar等利用Ralstonia eutropha H16为实验菌种,以廉价大豆油为碳源生产PHA,细胞干重可达118~126 g/L,PHA含量为 72%~76% (w/w)。研究表明,以廉价大豆油作为唯一碳源生产PHA,每克豆油可产生PHA0.72~0.76g,碳源成本降至0.4美元/kgPHA[31]。Pradella等利用大豆油为碳源,以Cupriavidus necator为出发菌种,研究表明当大豆油添加量为40g/L时,细胞干重最高可达83g/L,PHB含量为81% (w/w),PHB 产率为2.5 gL-1h-1,且磷、铜、钙、铁等元素的缺乏会限制细菌的生长和PHB的合成[32]。Fernández等通过Pseudomonas aeruginosa 42A2利用废的烹饪油和其他废油生产PHA,该菌株可以积累54.6%的PHA[33]。孙万东等用硫酸铵作氮源,以15g/L煎炸废油为碳源生产PHB时,PHB的含量和产量分别为82.1%、10.86g/L,PHB的产率为0.724gL-1h-1,相同情况下利用煎炸废油可以获得比纯豆油更高的PHB产量[21]。Verlinden等利用Cupriavidus necator 为实验菌种,以煎炸废油为底物生产PHA,PHA产量可达1.2g/L,与以葡萄糖为底物时浓度类似[34]。

5存在问题与展望

利用废弃油脂生产PHA提供了废弃油脂资源化途径,但同时也存在一些问题。废弃油脂组成较为复杂,且成分不稳定,其中含有不能被微生物利用的成分,或许会影响微生物发酵合成 PHA。利用废弃油脂生产的 PHA 分子量相对较小,且产品中容易存在油脂残留。相信随着科学技术的发展,必将解决PHA生产成本较高的问题,同时提高产品质量,并实现废弃油脂的资源化利用和高附加值产品的开发。

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通讯作者:任连海(1971—),男,河北人,副教授,主要从事固体废弃物处理处置方面的教学研究工作。

作者简介:刘慧(1990—),女,河北人,北京工商大学食品学院硕士研究生。

收稿日期:2014-12-04

中图分类号:X703

文献标识码:A

文章编号:1674-9944(2015)01-0263-03