归脾丸质量标准研究

归脾丸质量标准研究

高辉，李晓燕，李冰，林晓

(山东省食品药品检验研究院，山东 济南 250101)

摘要：目的提高归脾丸的质量标准。方法采用薄层色谱法对党参、炙黄芪、远志、当归进行鉴别；用高效液相色谱-蒸发光散射法测定黄芪中黄芪甲苷的含量，色谱柱为Diamonsil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相为乙腈-水(32∶68)；流速为1.0 mL·min-1，漂移管温度105 ℃，气体流量2.5 L·min-1。结果薄层色谱斑点清晰；黄芪甲苷在1.046 0～5.230 0 μg(r=0.999 8)的范围内线性良好，平均回收率为101.24%(n=6)，RSD为1.92%。结论本法结果准确、可靠，可用于该制剂的质量控制。

关键词：归脾丸；薄层色谱法；高效液相色谱-蒸发光散射法

基金项目：山东省自然科学

作者简介：高辉，女，主管药师，研究方向：药品检验和质量标准研究，E-mail：gaohui198311@126.com

通讯作者：李冰，男，主任药师，研究方向：化学药品检验，Tel：0531-81216513，E-mail：laaab123@gmail.com

中图分类号：R927.1文献标识码：A

Study on the quality standard of Guipi Pills

GAOHui，LIXiao-yan，LIBing，LINXiao

(ShandongInstituteforFoodandDrugControl,Jinan250101,China)

Abstract：ObjectiveTo improve the quality standard of Guipi Pills for better controlling the quality of drugs.MethodsThe TLC was employed on Radix Astragali,honey-fried Radix Astragali，Radix Polygalae,Radix Angelicae Sinensis for identification;The content of astragaloside in Radix Astragali was determined by HPLC-ELSD.A Dikma Diamonsil C18 column(4.6 mm×250 mm，5 μm)was adopted with methanol-water(32∶68) as mobile phase at a flow rate of 1 mL·min-1.An eweaporative light-scattering detector (ELSD) Model 2000 was used with the drift tube temperature at 105 ℃ and the gas flow rate at 2.5 L·min-1.ResultsThe TLC chromatographic spots were clear；The linear range of astragaloside was 1.046 0～5.230 0 μg(r=0.999 8)，the average recovery was 101.24%，and RSD=1.92%(n=6).ConclusionThe results showed that this method was accurate,reliable and can be used for the preparation of quality control．

Key words:Guipi Pills;Thin-layer chromatography;HPLC-ELSD

归脾丸由党参、炒白术、炙黄芪、炙甘草、茯苓等15味中药组成，具有益气健脾，养血安神功效。用于治疗心脾两虚，气短心悸，失眠多梦，头昏头晕，肢倦乏力，食欲缺乏，崩漏便血等[1]。近年来发现，归脾丸对神经衰弱、窦性心动过缓及阵发性心动过速、冠心病、更年期综合征、缺铁性贫血、慢性苯中毒亦有较好的改善作用[2～4]。为有效控制本品质量，采用薄层色谱法(TLC)对处方主要药味党参、炙黄芪和远志进行定性鉴别，并用高效液相色谱-蒸发光散射法(HPLC-ELSD)测定黄芪中有效成分黄芪甲苷的含量[5]，为全面控制产品质量提供依据。

1仪器与试药

Agilent 1100液相色谱仪；Alltech 2000 ELSD检测器；Sartorius CP225D电子天平；KQ-300DE超声波清洗仪。黄芪甲苷对照品(批号：110781-200512，中国药品生物制品检定所)；归脾丸(山东沃华医药科技有限公司，批号：060301、060202、080201)；阴性样品按处方制备；HPLC用甲醇、乙腈为色谱纯，水为超纯水；TLC用试剂为分析纯，水为纯化水。

2方法与结果

2.1色谱条件色谱柱：Diamonsil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；以乙腈-水(32∶68)为流动相；流速为1.0 mL·min-1，柱温35 ℃，漂移管温度105 ℃，气体流量2.5 L·min-1，进样量为10 μL。

2.2溶液的制备对照品溶液：精密称取黄芪甲苷对照品适量，加甲醇制成每1 mL含0.2 mg的溶液，即得。

供试品溶液：取本品重量差异项下的大蜜丸，剪碎，取约15 g，精密称定，精密加入甲醇100 mL，称定重量。密封，冷浸过夜，加热回流2 h，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液50 mL，水浴蒸干，残渣加水10 mL，微热使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取4 次，每次40 mL，合并正丁醇提取液，用氨水充分洗涤3 次，每次40 mL，弃去氨水，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇溶解，并转移至5 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

阴性对照溶液：取缺炙黄芪阴性对照样品，按比例同供试品的制备方法制得。

2.3薄层色谱鉴别

2.3.1党参的薄层色谱鉴别[1,6]取党参对照药材1 g，同“2.2”项下的供试品溶液制备方法制成对照药材溶液。同时取处方中除去党参的其他药味，按处方比例制成阴性对照样品，取约4.5 g，同供试品溶液的制备方法制成阴性对照溶液。吸取上述两种溶液及“2.2”项下的供试品溶液各10 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚(30～60 ℃)-甲酸乙酯-甲酸(15∶5∶1)的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365 nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；喷以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，而且阴性对照无干扰，结果见图1。

图1　党参的TLC鉴别图谱 1.供试品060301；2.供试品060202；3.供试品080201； 4.党参对照药材；5.缺党参阴性对照

2.3.2炙黄芪的薄层色谱鉴别[1,7]取黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液。同时取处方中除去炙黄芪的其他药味，按处方比例制成阴性对照样品，取约4.5 g，同供试品溶液的制备方法制成阴性对照溶液。吸取上述两种溶液及“2.2”项下的供试品溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水(13∶7∶2)的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃ 加热至斑点显色清晰，置紫外光灯(365 nm)下检视。结果供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，而且阴性对照无干扰，结果见图2。

图2　炙黄芪的TLC鉴别图谱

2.3.3远志的薄层色谱鉴别[1,8]取本品水蜜丸6 g，研碎；或小蜜丸或大蜜丸9 g，剪碎，加盐酸无水乙醇溶液(10→100)20 mL，加热回流30 min，放冷，滤过，滤液加水30 mL，用三氯甲烷振摇提取2次，每次20 mL，合并三氯甲烷液，蒸干，残渣加乙酸乙酯1 mL使溶解，作为供试品溶液。另取远志对照药材1 g，同法制成对照药材溶液。同时取处方中除去远志的其他药味，按处方比例制成阴性对照样品，取约4 g，同供试品溶液的制备方法制成阴性对照溶液。吸取上述3种溶液各2 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-冰醋酸(14∶8∶0.5)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，而且阴性对照无干扰，结果见图3。

图3　远志的TLC鉴别图谱

2.4含量测定[9,10]

2.4.1线性关系精密吸取0.209 2 mg·mL-1黄芪甲苷对照品溶液5、8、15、20、25 μL，注入液相色谱仪，以黄芪甲苷的进样量的对数值为横坐标，峰面积的自然对数值为纵坐标，进行线性回归，回归方程为：Y=1.315 7X+7.336 8，r=0.999 8，表明黄芪甲苷进样量在1.046 0～5.230 0 μg范围内与峰面积自然对数值呈良好的线性关系。

2.4.2精密度试验精密吸取0.209 2 mg·mL-1黄芪甲苷对照品溶液10 μL，注入液相色谱仪，连续进样5次。测定峰面积，以黄芪甲苷的峰面积的自然对数值计算，RSD为0.26%，表明仪器精密度良好。

2.4.3稳定性试验精密吸取同一份供试品溶液10 μL，注入液相色谱仪，每隔2 h进样1次，记录黄芪甲苷的峰面积，共考察10 h，以黄芪甲苷的峰面积的自然对数值计算，RSD为1.17%，表明被测溶液在10 h内稳定。

2.4.4重复性试验取同一批号的归脾丸约15 g，共5份，精密称定，按供试品溶液的制备方法制备，按上述色谱条件测定，测得平均含量0.13 mg·g-1，RSD为1.14%(n=5)。

2.4.5加样回收率试验称取已知含量的归脾丸(批号：060202，黄芪甲苷含量为0.130 6 g·g-1)约7.5 g，共6份，精密称定，分别精密加入黄芪甲苷对照品溶液(浓度0.209 2 mg·mL-1)各5 mL，按“2.2”项下操作方法制备，测定含量并计算回收率，结果平均回收率为101.24%，RSD为1.92%(n=6)。

2.4.6专属性试验分别精密吸取“2.2”项下对照品溶液、供试品溶液及阴性对照溶液各10 μL，注入液相色谱仪，测定。结果，阴性对照溶液在与对照品色谱相同保留时间的位置上未显色谱峰，故认为无干扰。结果见图4。

图4　归脾丸(A)、黄芪阴性对照(B)及黄芪甲苷对照品(C)色谱图

2.4.7样品含量测定取3批样品各2份，按照“2.2”项下的方法，分别制备样品溶液，进行测定，以外标法计算，测定结果见表1。

表1　样品测定结果

3讨论

3.1薄层色谱法分别对处方中主要药味党参、炙黄芪和远志制定了薄层色谱鉴别。各方法特征斑点鲜明，色谱分离清晰，并进行了耐用性考察，考察了不同薄层板(预制板和自制板)。结果证明对鉴别效果无明显的影响。

3.2高效液相色谱法

3.2.1提取方法的考察试验过程中考察了不同溶剂及提取方法(50%甲醇超声提取、甲醇回流提取、50%甲醇硅藻土拌样加热回流、甲醇冷浸过夜后回流)、不同取样量、提取时间和碱溶液。结果表明，取样15 g，甲醇100 mL作为提取溶剂，冷浸过夜后回流、正丁醇提取，并用氨水洗涤提取效果最好，故选之。

3.2.2流动相的选择参考有关资料，选择以下2种流动相进行试验：甲醇-水(75∶25)，乙腈-水(32∶68)。结果以乙腈-水(32∶68)的效果最为理想，故选之。

3.2.3耐用性的考察考察条件时使用了3种不同型号的色谱柱：Dikma Kromasil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)、Dikma Diamonsil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)、依利特Hypersil BDS C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，按上述确定的方法和条件进行测定，3种色谱柱所得的对称因子、理论板数等均能符合《中国药典》2010年版对高效液相色谱分析的有关要求，表明测定该方法测定黄芪甲苷，对色谱柱选择性不强，适用范围广。

3.2.4本试验结果表明，HPLC-ELSD法测定本制剂中黄芪甲苷的含量，具有简便、快速、重现性好的特点。同时，采用含量测定供试品溶液作为两个鉴别的供试品溶液，节约了成本和劳动力，为归脾丸质量标准提高提供了实验依据。

参考文献：

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典2005年版(一部)[S]．北京：化学工业出版社，2005:213.

[2] 王豪．归脾丸的13种新用途[J].家庭医药，2002，6：53．

[3] 李铭保．归脾丸可治疗多种心脏病[J].求医问药，2011，5：41．

[4] 李名．如何使用中成药治疗神经衰弱[J].求医问药，2012，2：45．

[5] 李培.高效液相色谱-蒸发光散射检测法测定消渴丸中黄芪甲苷的含量[J].药学研究，2014，33(5)：267-268.

[6] 付丽芳，付丽萍.健脾口服液中党参白术的薄层鉴别[J].时珍国医国药，2000，11(3):231．

[7] 林厚文，沈阳，沈利民,等.益心饮口服液薄层色谱鉴别研究[J].时珍国医国药，2001，12(5)：421-422．

[8] 余敏灵，王世强，蔡德友.桔梗冬花片的薄层色谱鉴别[J].时珍国医国药，2004，15(3)：158．

[9] 肖佳尚，朱涛.HPLC-ELSD法测定芪红胶囊中黄芪甲苷的含量[J].广东药学院学报，2007,23(2)：138-140．

[10] 李镜友，陈军，罗巧红,等.HPLC-蒸发光散射检测法测定益气温阳胶囊中黄芪甲苷的含量[J].中医药导报，2009,15(7)：85-86．