HPLC法测定抗丙肝新药CZYS-201402-04的有关物质

HPLC法测定抗丙肝新药CZYS-201402-04的有关物质

陶鑫1，焦丹丹2，吴卫忠3，张建军4，余洛汀1

(1.四川大学生物治疗国家重点实验室，四川 成都 610041；2.常州寅盛药业有限公司，江苏 常州 213033；

3.常州大学，江苏 常州 213164；4.中国药科大学，江苏 南京 210009)

摘要：目的采用高效液相色谱法测定新型丙型肝炎治疗药物CZYS-201402-04的有关物质。 方法采用Zorbax Eclipse Plus C18(4.6 mm×100 mm, 3.5 μm)，用二元梯度洗脱的方式，流动相A为10 mmol·L-1磷酸二氢钾溶液(pH 3.0)，流动相B为乙腈，检测波长为210 nm，柱温40 ℃，流速1.0 mL·min-1。结果CZYS-201402-04的峰能与相邻杂质峰完全分离。CZYS-201402-04定量限为0.039 ng(0.003 9 μg·mL-1)，最低检出限为0.013 ng(0.001 3 μg·mL-1)。重复性RSD=1.5%(n=6)，中间精密度RSD=1.4%(n=9)。样品溶液在24 h内稳定。结论该方法为CZYS-201402-04的有关物质检查提供了方便、灵活、精确、可靠的方法。

关键词：高效液相色谱法； CZYS-201402-04；有关物质

基金项目：“十二五”新药创制科技重大专项(No.2012ZX09103101079);江苏省科技支撑计划—社会发展项目(No.BE2014626)

作者简介：陶鑫，男，主管药师，研究方向：药物合成与质量控制，E-mail:taoxinmeter@163.com

通讯作者：余洛汀,男，博士研究生，教授，博士生导师，研究方向：药物化学、化学生物学和不对称合成化学，Tel：028-85503817，E-mail：luodyu@163.com

中图分类号：R927.1文献标识码：A

Determination of related substances of a novel anti-HCV drug CZYS-201402-04 by HPLC

TAOXin1,JIAODan-dan2,WUWei-zhong3,ZHANGJian-jun4,YULuo-ting1

(1.StateKeyLaboratoryofBio-therapyofSichuanUniversity,Chengdu610041,China;2.Changzhou

YinshengPharmaceuticalCo.,Ltd.,Changzhou213033,China;3.ChangzhouUniversity,Changzhou

213164,China;4.ChinaPharmaceuticalUniversity,Nanjing210009，China)

Abstract：ObjectiveTo establish an HPLC method for the determination of related substances of a novel anti-HCV drug CZYS-201402-04.MethodsZorbax Eclipse Plus C18(4.6 mm×100 mm,3.5 μm)column was used.The mobile phase A was water solution containing 10 mmol·L-1 potassium dihydrogen phosphate(pH 3.0)and the mobile phase B was acetonitrile.The UV detection wavelength was 210 nm,the column temperature was 40 ℃ and the flow rate was 1.0 mL·min-1.ResultsCZYS-201402-04 could be effectively separated with impurities.The LOQ was 0.039 ng (0.003 9 μg·mL-1) and LOD was 0.013 ng (0.001 3 μg·mL-1).RSD of repeatability was 1.4% and RSD of intermediate precision was 1.5%.The solution was stable in 24 h.Conclusion The method was convenient,sensitive,accurate and reliable for the determination of assay and related substances of CZYS-201402-04.

Key words:HPLC;CZYS-201402-04;Related substances

慢性丙型肝炎(Chronic Hepatitis C,CHC)是由丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus,HCV)引起的一种传染性肝脏疾病。目前全球约有2%的人感染了HCV，而每年约有35万人死于丙型肝炎相关的疾病[1]。中国在1999年HCV感染率约为1.1%(1 400万人)[2]，并且在最近几年呈逐渐上升趋势，每年新诊断病例接近20万人。HCV的感染者经过10～20年的潜伏期后，约有80%的人将发展为慢性丙型肝炎，20%的人将进一步发展成肝硬化，1%～4%的人将最终恶化转变为肝癌[3]。目前，临床上用于丙型肝炎治疗的直接抗病毒药物大致可以分为3类：① NS3/4A抑制剂，包括Telaprevir、Boceprevir、Simeprevir等；②NS5A抑制剂，包括BMS公司开发的Daclatasvir[4]和Ombitasvir等；③NS5B抑制剂，包括Sofosbuvir和Dasabuvir等。临床试验显示Daclatasvir可使病人体内的RNA水平下降约3.5 log10，与干扰素联用时对基因型1a的有效率为70%左右[5]。我国CHC患者的标准治疗方案是聚乙二醇干扰素-α与利巴韦林的联合应用，而美国、欧洲和日本近年来在开发直接抗病毒药物(DAAD)上取得了突破，一类新药CZYS-201402-04(药品代号)是针对丙型肝炎病毒NS5A靶点的的新型抑制剂。该化合物具有活性高、低毒性、高生物利用度等特点。在该药物的质量标准方面，尚无有关物质检测的方法报导。本文建立了CZYS-201402-04有关物质检查的HPLC方法[6,7]。

1仪器与试药

Agilent 1260 液相色谱仪，G1314F紫外检测器，G4212B DAD检测器，G1316A柱温箱，OpenLAB CDS EZChrom 色谱工作站。CZYS-201402-04对照品(含量：99.8%)，CZYS-201402-04精制品(批号：201402-04-140405,201402-04-140501，201402-04-140502，常州寅盛药业有限公司)；纯化水；乙腈、甲醇为色谱级；磷酸、磷酸二氢钾为国产分析纯。

2方法与结果

2.1色谱条件与系统适用性试验采用Zorbax Eclipse Plus C18(4.6 mm×100 mm,3.5 μm)色谱柱，用二元梯度洗脱的方式，流动相A为10 mmol·L-1磷酸二氢钾溶液(用磷酸调pH至3.0)，流动相B为乙腈，梯度洗脱程序[8]为0 min：A∶B=90∶10，10 min：A∶B=60∶40；25 min：A∶B=50∶50，30 min：A∶B=20∶80，35 min：A∶B=20∶80，后运行时间为5 min。检测波长为210 nm，柱温40 ℃，流速1.0 mL·min-1。进样体积10 μL。系统适用性试验要求在此色谱条件下分析，主峰的理论塔板数应不得低于3 000，主峰拖尾因子应不大于2.0，主峰与相邻峰的分离度应不得低于1.5。

2.2溶液配制及检测 照《中国药典》2010年版(二部)高效液相色谱法的要求[9]，取供试品30 mg，精密称定，置50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，混匀即得浓度为0.6 mg·mL-1样品溶液。照选定色谱条件，取10 μL注入液相色谱仪，记录色谱图，按面积归一化法计算，即得。色谱图见图1。

图1　空白(A)及供试品溶液(B)的色谱图

2.3专属性考察分别制备酸、碱、氧化、高温、高湿及强光照射破坏的样品溶液[10]，制成0.6 mg·mL-1的样品溶液，按“2.1”项下色谱条件，分别进样10 μL，记录色谱图，试验结果显示，在选定的色谱条件下，CZYS-201402-04与降解物质均能较好的分离，且主峰峰纯度均为0.95以上，没有杂质包夹的现象。6种降解条件下的色谱图见图2～7。

图2　高湿(RH 90%±5%)破坏的色谱图

图3　高温(105 ℃)破坏的色谱图

图4　酸(1 mol·L -1乙酸溶液)破坏的色谱图

图5　氧化(3%双氧水溶液)破坏的色谱图

图6　光照(4 500 Lx以上)破坏的色谱图

图7　碱(1 mol·L -1氢氧化钠溶液)破坏的色谱图

2.4定量限(LOQ)、最低检测限(LOD)的确定分别配制一系列不同浓度的CZYS-201402-04溶液，按照“2.1”项下色谱条件，分别进样记录色谱图。按照信噪比10∶1，测得CZYS-201402-04的定量限为0.039 ng(0.003 9 μg·mL-1)。按照信噪比3∶1，测得CZYS-201402-04的检测限为0.013 ng(0.001 3 μg·mL-1)。

2.5精密度试验(重复性和中间精密度)通过两人在不同时间进行样品的测定，记录色谱图，按面积归一化法计算纯度，检查进样精密度(重复性和中间精密度)，试验结果表明，本品有关物质检查的进样重复性RSD=1.5%(n=6)，中间精密度RSD=1.4%(n=9)。

2.6溶液稳定性取同一溶液进行数次测定，室温下放置0、2、4、6、8、10、12、18、24 h，分别按“2.1”项下色谱条件，分别进样10 μL，记录谱图。试验结果表明，CZYS-201402-04的主峰面积RSD=0.5%，样品在24 h内稳定。

2.7样品的测定分别精密称取3批供试品30 mg，精密称定，置50 mL容量瓶中，加稀释液溶解并稀释至刻度，混匀即得0.6 mg·mL-1的样品溶液。按“2.1”项下色谱条件，分别进行有关物质检测，3批样品的总杂质分别为1.0%、1.3%、1.1%。

3讨论

3.1检测波长的选择根据上述含量和有关物质的检查方法，对样品进行DAD检测，由光谱图可知，主要有关物质如原料、中间体、降解产物的最大吸收均在210 nm左右，反应副产物(位于主峰后)的吸收曲线与主峰一致，最大吸收在340 nm左右。为了有效检测杂质，若将检测波长设置为340 nm，则可能掩盖有关物质的数量和大小，因此，将检测波长定位210 nm。所制定的方法简单准确，灵敏度高。

3.2方法的选择该产品为创新药物，在临床前研究阶段尚未对已知杂质做非常深入的研究。在产品检测中来源于原料、中间体和降解产物的有关物质含量较少，而主要杂质为反应副产物(位于主峰后)，其吸收曲线与主峰相同，因此，选择面积归一化法可有效检测该主要杂质的含量。本文建立的方法可为一类新药CZYS-201402-04的后续研究提供一定的理论基础。

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