液液萃取—接受相固化—反萃取—气相色谱/质谱法测定奶粉中的香兰素

章建辉 李 莎 黄 辉 夏立新

(长沙市食品质量安全监督检测中心，湖南长沙 410013)

香兰素(3-甲氧基-4羟基苯甲醛，又称芳草醛)有浓烈的奶香气息，是重要的香料之一，广泛应用于医药、食品、农药、有机合成及药用辅料等领域。食用大剂量的香兰素可导致头痛、恶心、呼吸困难、损肝伤肾等，危害人体健康。GB 2760—2011食品添加剂使用标准中规定，0至6个月婴幼儿配方食品中不得添加香兰素，较大婴儿和幼儿配方食品中可以使用香兰素，最大使用量为5 mg/100 mL，但标准中并未提供相应的检测方法。目前常用的香兰素检测方法有电化学法［1］、分光光度法［2］、高效液相色谱法［3，4］、高效液相色谱/质谱法［5，6］、气相色谱法［7］和气相色谱/质谱联用法［8，9］。电化学法和分光光度法分析成本低，但操作繁琐，灵敏度差;高效液相色谱法和气相色谱法因简单、快速等优点而得到广泛应用，但易出现假阳性;高效液相色谱/质谱法因需要使用固相萃取柱对样品进行净化，样品处理成本高;气相色谱/质谱联用法有机溶剂消耗量大，易污染环境。

液液微萃取—悬浮溶剂固化法(solidification of floating organic drop liquid phase microextraction，LPME—SFO)是Zanjani等［10］于2007年提出来的一种新型萃取技术。该法选用凝固点较低且密度小于水的溶剂为萃取剂，萃取后低温冷却，萃取剂凝结成固体悬浮于水相表面，取出固化的萃取剂与水相分离，待萃取剂溶化后进样分析。该方法选择的萃取剂毒性小，萃取剂固化后易取出，在简单基质中对目标物进行分离富集方面具有很好的优势，并得到应用［11－14］。LPME—SFO需要的微量有机溶剂在冷冻或低温条件下能够凝固，有机溶剂选择性小，限制了该法的应用。石慧等［15］对LPME—SFO进行改进，选择酸性水溶液为固化剂来分离减肥茶中的西布曲明，并取得很好的试验效果。目前涉及香兰素检测的方法中接受相固化—反萃取技术尚未见报道，本研究拟在前人研究基础上提出一种液液萃取—接受相固化—反萃取新方法，该方法利用萃取剂对目标物萃取后，选择碱性水溶液为接受相，低温下将水相固化后去除有机相，室温溶解后用有机相再进行反萃取。本研究旨在为奶粉中香兰素的测定提供新方法，为食品安全的监测、预警及控制提供必要的技术支持。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

乙醇、二氯甲烷、三氯甲烷、乙醚:色谱纯，国药集团化学试剂有限公司;

氢氧化钠、盐酸、无水硫酸钠:分析纯，国药集团化学试剂有限公司;

无水硫酸钠:优级纯，国药集团化学试剂有限公司;

香兰素标准品:质量分数为99.7%，瑞士Fluka公司。

1.2 仪器与设备

气相色谱质谱联用仪:Agilent 7890A/5975C型，美国Agilent公司;

氮吹仪:OA-SYS型，美国Organomation公司;

漩涡混合器:SK-1型，金坛市医疗仪器厂;

高速离心机:CT 14D型，上海天美科学仪器有限公司;

电子天平:AL204型，梅特勒—托利多仪器上海有限公司。

1.3 方法

1.3.1 香兰素标准储备液 称取0.1 g(精确至0.000 1 g)的香兰素标准品于100 mL容量瓶中，用二氯甲烷溶解并定容至刻度线，配成质量浓度为1.0 mg/mL的标准储备液，于4℃保存备用

1.3.2 香兰素标准工作液 准确吸取1.0 mg/mL的香兰素标准储备液，用二氯甲烷逐级稀释配成0.20，0.50，1.0，2.0，5.0，10.0 μg/mL 的标准工作液。

1.3.3 样品处理 取0.5 g(精确至0.000 1 g)样品于离心管中，加1.0 mL蒸馏水(盐酸调节蒸馏水pH为4.0～6.0)溶解奶粉后，加乙醚涡旋提取2 min，加适量无水硫酸钠后，9 000 r/min离心5 min。乙醚7 mL(3，2，2 mL)提取 3 次，合并提取上清液至10 mL尖底离心管中。取0.01 mol/L氢氧化钠溶液100 μL加入到提取液中，涡旋2 min，5 000 r/min离心3 min。－20℃下冰冻10 min。待水相固化后，低温下迅速移除上层有机相，室温下将水相溶解。水相中加入0.5 mol/L盐酸20 μL，混匀后加入二氯甲烷1.00 mL，涡旋提取2 min后，5 000 r/min离心3 min，取下层溶液进样分析。

1.3.4 香兰素提取与净化单因素条件

(1)萃取方法和萃取剂的选择:选取相同浓度加标样品，使用4种不同萃取剂(乙醚、乙醇、二氯甲烷、三氯甲烷)对奶粉中香兰素进行提取。试验选用样品加萃取剂直接涡旋提取(干提取)和溶解后再加萃取剂涡旋提取(湿提取)两种方式，计算萃取率。

(2)接受相pH值对萃取率的影响:取5份相同浓度加标奶粉样品，分别使用 pH 为 8.0，9.0，10.0，10.7，11.0，11.7，12.0的氢氧化钠溶液200 μL对加标样品进行萃取，计算萃取率。

(3)接受相体积对萃取率的影响:取5份相同浓度加标奶粉样品，乙醚提取后，考察了0.01 mol/L氢氧化钠溶液不同体积下的萃取效果，体积分别选择为50，80，100，120，150 μL，计算萃取率。

(4)反萃取剂的选择:试验选取相同浓度的标准品，考察了不同反萃取溶剂(乙醚，乙醇，二氯甲烷，三氯甲烷)对香兰素响应的影响。

1.3.5 色谱和质谱条件

(1)气相色谱条件:VF-wax MS毛细管柱(30 m×0.25 mm ×0.25 μm);载气:He(＞ 99.999%);柱温流量:1 mL/min;进样口温度:250℃;分流比1∶10;进样量1 μL;柱升温程序:初始温度80℃，保持1 min，以20℃/min速率升温至180℃，保持4 min，再以10℃/min升温至260℃，保持1 min。

(2)质谱条件:EI离子源温度230℃;四级杆温度150℃;碰撞能量70 eV;传输线温度280℃;质谱接口温度230℃;溶剂延迟5 min;选择离子检测(SIM)模式的主要离子的m/z 151，152，81，109。

2 结果与分析

2.1 萃取方法和萃取剂的选择

由图1可知:样品直接提取时，4种萃取剂回收率偏低;样品溶解后再提取时，4种萃取剂回收率高。因此选用样品溶解后再提取的方法对样品进行提取。

图1 萃取剂及方法对奶粉中香兰素提取率的影响Figure 1 Effect on the extraction rate of vanillin from powdered milk by different extraction solvents and methods

采用样品溶解方法提取香兰素时，乙醇与水互溶，萃取后难以除水，氮吹浓缩时需加入碱防止目标物挥发，操作繁琐;二氯甲烷和三氯甲烷密度比水大，离心后样品上浮，也不易操作。乙醚提取效果好，且操作方便。因此选择乙醚为萃取剂。

2.2 净化条件的选择

2.2.1 接受相pH值对萃取率的影响 香兰素结构中含有酚羟基，在碱性条件下以离子形式存在，酸性条件下以分子形式存在。在碱性条件下，易将香兰素从有机相中提取出来。试验以氢氧化钠溶液为接受相，比较不同pH值对萃取率的影响。由图2可知:随着pH值的增大，萃取率升高;当pH值大于11.0后，萃取率大于96%。为满足对高浓度目标物萃取，最终选择pH=12.0的氢氧化钠溶液为接受相。

图2 接受相pH值对提取率的影响Figure 2 Effect on the extraction rate of vanillinin different pH value

2.2.2 接受相体积对萃取率的影响 由图3可知:反萃取率先随反萃取剂体积增加而增加;当氢氧化钠溶液用量为100 μL时，萃取率为98.1%;当氢氧化钠溶液体积大于100 μL时，反萃取率变化不大。氢氧化钠溶液用量增大，固化时间将延长。因此选定氢氧化钠的用量为100 μL。

2.2.3 反萃取剂的选择 氢氧化钠溶液为接受相进行反萃取时，香兰素以盐的形式被提取出来，大部分干扰物存在于有机相中，样品得以净化。接受相体积很小，液态下难以将两相完全分离。本试验采用接受相固化的方式去除有机相。在－20℃下冰冻10 min，水相成为固化态，然后低温下迅速去除有机相。室温溶解后，用20 μL 0.5 mol/L盐酸将溶液酸化，香兰素以分子形式存在接受相中。

图3 接受相体积对萃取率的影响Figure 3 Effect on the extraction rate of vanillin in different volume

试验分析了乙醚、乙醇、二氯甲烷、三氯甲烷等溶剂对香兰素响应的影响。乙醚对香兰素响应不稳定，并且会造成香兰素无响应，原因可能是在气相进样口高温条件下，乙醚与香兰素反应产生了聚合物。乙醇、二氯甲烷、三氯甲烷对香兰素响应值大并且稳定，但乙醇与水互溶，萃取后难以分离，三氯甲烷毒性比二氯甲烷大。本试验最终选择二氯甲烷为反萃取溶剂。

2.3 分析条件的确定

2.3.1 色谱条件确定 在1.3.5气相色谱分离条件下，首先通过GC—MS的全扫描方式(m/z 50～200)得到总离子流色谱图(TIC)(见图4)，然后根据TIC谱图来选择相对丰度较高和质荷比(m/z)较大离子进行分析。

图4 香兰素的质谱图Figure 4 Mass spectrum of vanillin by GC/MS

2.3.2 仪器定性定量方式 利用质谱对目标物进行准确定性，需要了解EI—MS谱图中碎片离子的归属，故对其特征碎片离子的可能碎裂机理进行初步解析(见图5)。选择 m/z 151为定性离子，m/z 152，81，109为定量离子。

2.4 工作曲线，检出限，方法回收率、精密度

图5 香兰素的EI—MS碎片离子结构Figure 5 The structure of vanillin EI－MS fragments

将香兰素标准溶液稀释成 0.20，0.50，1.0，2.0，5.0，10.0 μg/mL，在本试验确定的试验条件下进行测定，并绘制标准曲线。以浓度(C，μg/mL)为横坐标，色谱峰面积为纵坐标(A)，得到线性方程 A=32 509.0C －7 716.4，相关系数0.999 5。结果表明在 0.20 ～10.0 μg/mL 范围内线性关系良好，方法检出限(S/N=3)为 0.004 mg/kg。

选取阴性样品，香兰素的加标水平为:0.50，1.0，4.0 μg/mL 3个浓度水平的加标回收试验，相关色谱图见图6;每个样品连续测定6次，测定精密度和加标回收率(见表1)。结果表明:回收率为82.0% ～98.0%，相对标准偏差小于6.83%。

图6 香兰素标准溶液离子流色谱图和样品加标离子流谱图Figure 6 The ion chromatograms of standard of vanillin and spiked sample

表1 精密度和回收率的测定Table 1 Determination of RSD and recovery rate(n=6)

2.5 与其它方法的比较

运用本试验建立的方法与文献方法比较可知(见表2):本试验有机萃取溶剂消耗少，检出限低，说明本方法具有很强的适用性。

表2 不同测定方法结果比较Table 2 Comparison results of different methods

3 结论

目前关于香兰素检测的方法较多，但对其分离净化的研究报道相对较少。本试验建立液液萃取—接受相固化—反萃取的新方法与传统的检测方法相比，简化了分离净化过程、操作简单、无需浓缩、试剂消耗少、灵敏度高、检出限低，还减少了检测的假阳性现象，有望在将来为制定奶粉样品中香兰素的国标检测方法提供依据。

1 邱萍，倪永年.微分脉冲伏安法测定食品中的香兰素［J］.南昌大学学报(理科版)，2002，26(2):124 ～127.

2 张国文，倪永年.多元校正—光度法同时测定食品中的香兰素和乙基麦芽酚［J］.分析科学学报，2005，21(1):20 ～23.

3 景丽杰，韩伟.用反相高效液相色谱法测定香兰素含量［J］.食品科学，2006，27(4):205 ～207.

4 赵志红，张逢秋.反相高效液相色谱法同时测定食品中香兰素、乙基麦芽酚的含量［J］.食品科技，2006(12):136～138.

5 韩超，刘滨.液相色谱—串联质谱法同时测定婴幼儿配方奶粉中4种香料［J］.分析测试学报，2014，33(2):208～211.

6 Lowri S，Jager D，Gracia A.Comparison of head-space SPME—GCMS and LCMS for the detection and quantification of coumarin，vanillin and ethyl vanillin in vanilla extract products［J］.Food Chemistry，2008，107(4):1 701 ～1 709.

7 欧菊芳，顾秀英.气相色谱法测定婴幼儿配方奶粉中香兰素和乙基香兰素［J］.江西科学，2011，29(1):23 ～25.

8 韩双，杨金宝.气相色谱—质谱/选择离子法测定牛奶中的香兰素［J］.中国乳品工业，2008，36(8):53 ～55.

9 乙小娟，朱加叶.气相色谱—质谱法测定巧克力中香兰素、特丁基对苯二酚、咖啡因［J］.理化检验(化学分册)，2009(12):1 404 ～1406.

10 Zanjani M R K，Yamini Y，Shariati S.A new liquid-phase microextraction method based on solidification of floating organic drop［J］.Analytica.Chimica.Acta，2007，585(2):286 ～293.

11 翦英红，胡艳.分散液液微萃取—上浮溶剂固化/高效液相色谱法测定沉积物中的十溴联苯醚［J］.分析化学，2010，38(1):62～66.

12 王宇，邹晓莉.混合萃取剂—悬浮固化分散液相微萃取测定尿中的苯巯基尿酸［J］.分析化学，2013，41(5):749 ～753.

13 Zhang Jing-Wen，Ke Xiao-jing.Development of dispersive liquidliquid microextraction based on solidification of floating organic drop for determination of trace cobalt in water samples［J］.Journal of the chinese Chemical Society，2011，58(7):911 ～918.

14 Zhang Jing-Wen，Wang Yu-kun.Development of dispersive liquidliquid microextraction based on solidification of floating organic drop for determination of trace lead in water samples［J］.CLEAN-Soil，Air，Water，2011，39(12):1 095 ～ 1 098.

15 石慧，夏丹.分散液液微萃取—反萃取—接受相固化—高效液相色谱法测定减肥茶中的西布曲明［J］.分析化学，2013，41(9):1 444～1 448.