苦楝水提取液对兔球虫卵囊孢子化率的影响观察

李 波 ，游 浩 ，沈昆伟 ，周春雷 ，赵汝放

（1.四川省绵阳市动物疫病预防控制中心，四川 绵阳 621000；2.重庆市合川区畜牧站，重庆 合川 401520；3.四川省绵阳市涪城区动物疫病预防控制中心，四川 绵阳 621000；4.四川农业大学，四川 温江 611130）

兔球虫病是由艾美耳属的多种球虫寄生于家兔肝胆管及肠上皮细胞内引起的一种常见的寄生性、多发性原虫病[1]，具有很高的发病率和死亡率，是养兔场及散养户最常见的危害最大的流行性寄生虫病之一[2]。目前对兔球虫病的防治多以抗球虫化学药物为主[3]，如新洁尔灭、氯苯胍、10%福尔马林、地克珠利、莫能菌素等[4]。虽然这些药物在短期内对球虫病有一定的治疗效果，但长期使用会使球虫产生抗药性，而患病耐过家兔的粪便也会污染环境，使得感染反复循环[5]。

与化学药物的作用效果比较，中药对兔球虫病的治疗就比较独特。因为中草药长期使用不会出现抗药性，毒副作用较小，具有杀毒抑菌、促进机体生长和提高机体免疫力的作用[6]。已有研究发现这些中草药对兔球虫卵囊的发育有影响：川楝子、鱼腥草、皂角、大蒜、洋葱、葫芦茶、石榴皮、常山、穿心莲、白头翁、侧柏叶、苦参、山楂、鹅胆子、甘草等。苦楝子为楝科植物楝树的干燥成熟果实。苦楝子与川楝子为同科同属不同种植物，两种果实的性状、成分、药效略有不同，应分别入药，不宜混淆。据《神农本草经》和《本草纲目》记载，苦楝子有驱虫作用，其乙醇提取物的作用强，缓慢而持久。本试验研究了苦楝子提取物对兔球虫卵囊的杀灭效果，为中药治疗兔球虫病提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验中药 苦楝子，由绵阳市涪城区动物疫病预防控制中心提供。

1.1.2 球虫卵囊 兔球虫卵囊从感染了球虫病的家兔粪便中提取。

1.1.3 试验动物 3个月健康家兔，由绵阳市涪城区某公司提供。

1.1.4 试验试剂 苦楝子、乙醇、饱和食盐水、重铬酸钾、次氯酸钾。

1.1.5 所用仪器 显微镜、电热恒温培养箱、粉碎机、离心机、电子天平。

本次试验于2014年5月在四川农业大学国家级动物实验教学中心进行。

1.2 试验方法

1.2.1 对苦楝水提取物的试验观察 先在小平皿内加入预先稀释好的球虫卵囊悬液4mL，再分别加入质量浓度为 1、0.5、0.25 g/mL的苦楝水提取物4mL，另外加入4mL 2.5%重铬酸钾溶液作阴性对照和4mL次氯酸钾作阳性对照。将每组混匀，于28～30℃下恒温培养，第24、48h和72h时分别检查计数每组的卵囊孢子化率。

1.2.2 中药成分的提取 选取表面光滑、形状规则的苦楝子作原料，用毛刷刷洗干净，去蒂、籽和瓤，切成薄片，晾干，用烤箱烘干（80℃）至干透后，冷却至室温，用粉碎机粉粹，过筛制成20g的苦楝子粉。将苦楝子粉加纯水适量（以水面浸没苦楝子粉为宜），浸提2次：分别浸泡 12、24 h，沸水开 30 min后，放冷，过滤，合并滤液，然后水浴浓缩至中药浓度为2g/mL[7]。

1.2.3 兔球虫卵囊的收集 利用兔球虫进行培养，使其孢子化，然后将孢子化卵囊感染正常家兔，观察家兔的生理变化，用饱和食盐水漂浮法从家兔粪便中检测是否含有球虫。具体方法如下：

电子天平上称取100g含有兔球虫卵囊的新鲜兔粪于烧杯中，加入饱和食盐水浸泡捣烂，用过滤网将粪便残渣滤去，滤液倒入离心管中，2500r/min离心7min，弃去上清液，保留沉淀物（卵囊）；再向离心管中加入饱和食盐水，3500r/min离心20min，得沉淀物；将沉淀物置于适量的含2.5%重铬酸钾溶液的平皿内，然后将其平均分成25份，分别倒入5个6孔细胞培养皿的孔内，做好标记。

1.2.4 不同浓度中药提取液对兔球虫卵囊孢子化率的影响 用2.5%重铬酸钾溶液将苦楝子中药配制成1、0.5、0.25 g/mL的浓度梯度，同时以2.5%重铬酸钾溶液作阴性对照，次氯酸钾作阳性对照。于上述1.2.3的细胞培养皿孔内加入中药及对照溶液（4 mL/孔），摇匀，然后放入27℃恒温培养箱中培养，于0、24、48h及72h时进行球虫卵囊计数，并计算出每组的卵囊孢子化率。

1.3 数据处理采用麦氏计数法计算出每克粪便中未孢子化和已孢子化的球虫卵囊数个数（OPG）。

OPG=（A 片+B 片）÷2×100（国标，2003）[8]

孢子化率（%）=孢子化卵囊/（孢子化卵囊+未孢子化卵囊）×100%。

1.4 数据分析运用SPSS 20.0 for Windows软件对所得试验数据进行统计学处理，观察结果采用X±SD表示，用卡方检验判断差异的显著性。

2 结果

2.1 相同时间不同浓度的药物对球虫卵囊孢子化率的影响（见表1）在24h时，1g/mL的苦楝水提取物对兔球虫卵囊孢子化的影响大于其他组，0.5g/mL和0.25g/mL苦楝水提取物的效果一样，且大于阴性对照组；在48h时，1g/mL的苦楝水提取物对兔球虫卵囊孢子化的影响大于其他组，0.5 g/mL的效果大于0.25g/mL和阴性对照组，0.25g/mL和阴性对照组的效果一样；72h时的效果和48h的效果一样。

表1 不同时间不同浓度药物对兔球虫卵囊孢子化率的影响结果（ΔX±SD）

2.2 相同浓度药物在不同时间对球虫卵囊孢子化率的影响从表1可见，在不同时间，1g/mL的苦楝水提取物对兔球虫卵囊孢子化率的影响最大，效果好于阴性对照组，看图1可以说明效果最好；0.5g/mL的苦楝水提取物对兔球虫卵囊孢子化率的效果好于阴性对照组，看图2可以说明效果一般；0.25g/mL的苦楝水提取物对兔球虫卵囊孢子化率的影响最小，看图3可以说明效果几乎没有。

图1 1g/mL苦楝水提取物与对照组的对比

图2 0.5g/mL苦楝水提取物与对照组的对比

图3 0.25g/mL苦楝水提取物与对照组的对比

3 讨论

球虫卵囊经病兔粪便排出后，需在外界适宜的环境中进行孢子生殖，发育为孢子化卵囊后才具有致病性。所以球虫卵囊体外孢子化率的高低直接影响球虫卵囊的致病力。本病的传染多数因家兔食入被球虫卵囊污染的饲料或饮用水，或者家兔排出的粪便中带有球虫卵囊，对兔舍清扫消毒不彻底而致病[9]。兔球虫病一年四季均可发生和流行，特别是在温暖、雨水较多的春、夏季节，该病常呈地方性流行[10]。当温度在20～28℃范围内，相对湿度在55%～75%范围内，并且氧气充足的时候，兔球虫卵囊经过2～3 d便可以发育成熟并且具有一定的感染力。

现阶段，有人用苦楝子作为猪的驱虫药，并在用药量方面作了探讨。苦楝子的主要成分有苦楝素、挥发性脂肪酸、山茶酚、树脂、鞣质等。苦楝子具有驱猪蛔虫的作用，猪对苦楝子的敏感性比其他动物更强，但用苦楝子驱猪蛔虫，易发生中毒，这主要是因为未按照体重计算用药量。试验表明，采用苦楝子驱猪蛔虫的最适剂量为每千克体重6.0～11.79 g，有效率可达75%。还有人做了苦楝子对钉螺杀灭作用的研究，结果也证明苦楝子提取液对钉螺有较强的杀灭作用，且以70%乙醇提取的药液的效果最好，其半数致死浓度只有381.2mg/L。

[1] 王玺德，盛书娟，祝建平，等.石榴皮提取物对离体培养兔球虫卵囊的杀灭作用[J].中国畜牧兽医，2012，39（2）:212.

[2] 代德华，杨增岐.兔球虫病流行特点及其防控[J].畜牧与饲料科学，2012，33（1）：96-97.

[3] 朱楼英，何忠平，余建国.兔球虫病药物防治的进展[J].福建畜牧兽医，2010，32（3）：35.

[4] 郭明生.不同化学药物抑杀兔球虫卵囊试验[J].中国养兔杂志，1994（4）：8-9.

[5] 郭莉，毛光琼，阳爱国，等.兔球虫病的危害及防治进展[J].四川畜牧兽医，2011，38（10）：29-30.

[6] 张国.中草药对兔球虫卵囊孢子化的影响[J].新疆畜牧业，2012（7）：16-18.

[7] 曾灶昌，钟超.苦楝子中有效成分的提取分离及促进胆固醇流出作用研究[J].中外医疗，2008（16）：12-13.

[8] 秦建华，李国清.动物寄生虫病学实验教程[M].北京：中国农业大学出版社，2007.

[9] 贾路，王彦，石清来.球虫病对兔的危害与防治[J].中国畜禽种业，2012（5）：114.

[10]方宗敏，兔球虫病的发病机制、诊断和综合防制[J].中国动物检疫，2012，9（7）：55.