类风湿关节炎患者外周血CD4 T细胞关节局部趋化机制

类风湿关节炎患者外周血CD4 T细胞关节局部趋化机制

王克军

(荆州市中心医院骨二科，湖北荆州434020)

摘要〔〕目的探讨类风湿关节炎(RA)患者外周血CD4 T细胞比例变化情况及其对关节局部趋化的机制。方法流式细胞术分析RA患者外周血单个核细胞(PBMC)中CD4 T细胞的比例，并分析CD4 T细胞比例与RA 疾病活动性评分系统(DAS28)评分间的关系。激光共聚焦方法检测RA患者滑膜局部浸润CD4 T细胞情况。流式细胞术分析RA患者CD4 T细胞表面趋化因子受体表达情况。结果与对照组相比，RA患者外周血PBMC中CD4 T细胞的比例显著降低(P<0.01)，且RA患者外周血CD4 T细胞比例与DAS28评分呈明显负相关(r=-0.753 0，P=0.001 2)。关节局部CD4 T细胞浸润的激光共聚焦结果显示，与对照组相比，RA患者滑膜中具有更多的CD4 T细胞浸润。趋化因子受体分析结果显示，RA患者外周血CD4 T细胞表面CCR5、CXCR1和CXCR3的表达显著升高(P<0.01)。结论RA患者外周血CD4 T细胞表面表达升高的CCR5、CXCR1和CXCR3可能参与外周血CD4 T细胞向滑膜局部的趋化。

关键词〔〕类风湿关节炎；外周血；CD4 T细胞；关节；趋化

中图分类号〔〕R593.22〔文献标识码〕A〔

第一作者：王克军(1970-)，男，硕士，副主任医师，主要从事关节和脊柱研究。

类风湿关节炎(RA)其病理特征主要表现为：(1)以T淋巴细胞等炎症细胞浸润及其分泌的大量炎症细胞因子如肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-6、IL-1、γ-干扰素(IFN-γ)等引起的慢性、持续性滑膜炎症；(2)由单核细胞在炎症部位分化为有活性的破骨细胞(OC)所介导的侵蚀性、进行性骨质破坏〔1～4〕。CD4+T细胞作为IL-2、TNF-α、IFN-γ等细胞因子的主要来源，其免疫分化异常是RA 等系统性自身免疫性疾病发病的主要免疫病理机制之一〔5〕。目前关于外周血CD4 T细胞是否可趋化至RA患者滑膜局部参与RA发病及相关的机制研究的还不是很清楚。本研究首先通过流式细胞术分析RA患者外周血单个核细胞(PBMC)中CD4 T细胞的比例，并分析CD4 T细胞比例与RA 疾病活动性评分系统(DAS28)评分间的关系；通过激光共聚焦方法检测RA患者滑膜局部浸润CD4 T细胞情况及流式细胞术分析RA患者CD4 T细胞表面趋化因子受体表达情况，以明确外周血CD4 T细胞关节局部趋化机制。

1材料与方法

1.1临床资料收集2014年3～12月入院检查诊断为RA且临床资料完整的初治患者15例，同时收集健康体检患者15例。RA患者平均年龄(46.56±8.42)岁，均符合1987年美国风湿病学学会RA分类标准。对照组平均年龄(47.42±10.34)岁。通过RA患者DAS28评分软件计算15例患者RA患者DAS28评分。

1.2主要试剂Ficoll淋巴细胞分离液购自GE Healthcare公司；流式细胞染色的CD4抗体、CCR1-CCR10、CXCR1-CXCR6和CX3CR1购自Biolegend公司；激光共聚焦实验所有CD4抗体购自R&D公司；PRMI-1640购自Hyclone公司；滑膜组织冰冻切片由公司代为完成。

1.3外周血单个核细胞获取方法抽取RA患者及对照组空腹外周血1 ml，通过Ficoll淋巴细胞分离液分取PBMC。具体方法：采用PRMI-1640对采集的外周血进行1∶1的稀释，将稀释的外周血加入预先装有淋巴细胞分离液的15 ml离心管中(稀释血：淋巴细胞分离液=2∶1)；1 800 r/min离心20 min，吸取中间白膜层加入预先装有PRMI-1640的15 ml离心管中，1 500 r/min离心15 min；弃去上清再以PRMI-1640洗涤1次；采用台盼蓝计数用于后续实验。

1.4流式细胞染色方法按照每个染色条件1×106个细胞取所需细胞数。细胞采用含1%胎牛血清(BSA)的磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤2次，加入相应的抗体，4℃孵育30 min，随后采用含1%BSA的PBS洗涤2次；细胞以100 μl含1%BSA的PBS重悬进行检测。

图1　RA患者外周血CD4 T细胞比例与DAS28相关性分析

1.5激光共聚焦染色方法冰冻切片以1 ml PBS洗2次；4%多聚甲醛1 ml室温固定20 min；1 ml PBS洗2次；含3 μg/ml CD4抗体的染色Buffer室温染色1 h；1 ml PBS洗3次，5 min/次；将片子于空气中吹干；ProLong Gold Antifade Reagent封片。

1.6统计学方法采用Graphpad prism 5.0分析软件进行t检验和Pearson相关分析。

2结果

2.1RA患者外周血CD4 T细胞比例变化情况RA患者外周血CD4 T细胞比例为(22.6±5.24)%，显著低于对照组的(38.9±7.34)%(P<0.01)。

2.2RA患者外周血CD4 T细胞比例与病情相关性分析RA患者外周血CD4 T细胞比例与RA患者DAS28评分呈明显负相关(r=-0.753 0，P=0.001 2)。见图1。

2.3RA患者滑膜局部CD4 T细胞浸润情况分析RA患者滑膜局部浸润CD4 T细胞数为(58.96±7.38)，显著高于对照组的(3.00±2.26)(P<0.01)。

2.4RA患者外周血CD4 T细胞表面趋化因子受体表达情况分析同对照组相比，RA患者外周血CD4 T细胞表面CCR5、CXCR1和CXCR3的表达显著升高(P<0.01)。见图2。

图2　流式细胞染色检测RA患者外周血CD4 T细胞 表面趋化因子受体表达情况

3讨论

RA是一种慢性自身免疫性疾病，关节炎症和自身抗体产生为发病的关键因素〔6〕。RA的发病过程目前还未完全研究清楚。流行病学调查显示，RA 的全球发病率约为1%。RA 病程反复迁延，发病1年内致残率高达20%，是造成人类劳动力丧失和致残的主要原因之一。遗憾的是，目前所采用的治疗手段仅可降低RA 患者的致残率，但仍无法从根本上阻止RA 的炎症性关节破坏〔7〕。

大量研究证据表明，滑膜局部浸润炎性细胞产生的细胞因子在RA关节病变中具有重要的作用〔8〕。T细胞亚群对机体免疫功能的稳定起着重要的调节作用，研究显示T细胞在滑膜局部的浸润数量明显升高，局部浸润的T细胞在 RA滑膜关节处形成类似于异位淋巴细胞生发中心的结构。T细胞主要分为具有杀伤功能的CD8 T细胞和具有辅助功能的CD4 T细胞。CD4 T 细胞作为IL-2、TNF-α、IFN-γ等细胞因子的主要来源，其免疫分化异常是RA 等系统性自身免疫性疾病发病的主要免疫病理机制之一〔5〕。目前关于CD4 T 细胞在RA患者关节局部的浸润情况及相关机制研究还不是很清楚。

本研究结果初步提示，RA患者外周血CD4 T细胞比例的降低并非是对RA发病的一种保护作用，而可能是被趋化至RA滑膜局部参与RA发病。细胞的局部趋化与趋化因子和趋化因子受体的相互作用密切相关。同时，本研究还证实RA患者外周血CD4 T细胞表面表达升高的CCR5、CXCR1和CXCR3可能参与外周血CD4 T细胞向滑膜局部的趋化。

4参考文献

1Malysheva O，Bedrich A，Kuipers JG，etal.Use of clinical scores to guide therapeutic decisions in patients with rheumatoid arthritis in daily care〔J〕.Clin Exp Rheumatol，2015；33(2)：255-8.

2Kim HR，Kim KW，Kim BM，etal.The effect of vascular endothelial growth factor on osteoclastogenesis in rheumatoid arthritis〔J〕.PLoS One，2015；10(4)：e0124909.

3Sacks HS.Review：Some TNF inhibitors increase adverse events in patients with rheumatoid arthritis〔J〕.Ann Intern Med，2015；162(8)：JC10.

5Kosmaczewska A，Ciszak L，Swierkot J，etal.Alterations in both the activatory and inhibitory potential of peripheral blood CD4+T cells in rheumatoid arthritis patients correlate with disease progression〔J〕.Pathol Oncol Res，2014；20(2)：235-43.

6Greisen SR，Schelde KK，Rasmussen TK，etal.CXCL13 predicts disease activity in early rheumatoid arthritis and could be an indicator of the therapeutic'window of opportunity〔J〕.Arthritis Res Ther，2014；16(5)：434.

7van der Linden MP，le Cessie S，Raza K，etal.Long-term impact of delay in assessment of patients with early arthritis〔J〕.Arthritis Rheum，2010;62(12)：3537-46.

8McInnes IB，Schett G.Cytokines in the pathogenesis of rheumatoid arthritis〔J〕.Nat Rev Immunol，2007;7(6)：429-42.

〔2015-04-11修回〕

(编辑袁左鸣/滕欣航)