重组IL-12逆转录病毒转染树突细胞体外对鼻咽癌细胞的杀伤作用

重组IL-12逆转录病毒转染树突细胞体外对鼻咽癌细胞的杀伤作用

朱欠元曾常爱肖帆李宝金1

(井冈山大学临床医学院耳鼻喉科，江西吉安343000)

摘要〔〕目的体外实验评估重组白细胞介素(IL)-12逆转录病毒转染树突细胞对鼻咽癌细胞的杀伤作用。方法构建重组IL-12重组逆转录病毒，体外转染树突细胞(DC)，经培养后收集上清液，检测IL-12、干扰素-γ(IFN)的分泌水平。以鼻咽癌细胞CNE-2为靶细胞，进行细胞毒T淋巴细胞(CTL)细胞毒活性测定。结果成功构建含有mIL-12的重组逆转录病毒；IL-12基因修饰DC可以显著诱导的大量IL-12和IFN-γ分泌，与未转染DC组比较，差异有显著意义(P<0.01)；DC-IL-12诱导的CTL及其上清液对鼻咽癌细胞CNE-2均有显著杀伤作用，与未转染DC组相比较差别有显著(P<0.01)。结论IL-12基因修饰树突细胞可显著诱导大量IFN-γ分泌并增强其诱导特异性CTL对肿瘤的杀伤效能。

关键词〔〕IL-12基因；树突细胞；鼻咽癌

中图分类号〔〕R739.63〔文献标识码〕A〔

基金项目：国家自然科学基金资助项目(81350022)

通讯作者：曾常爱(1962-)，男，副教授，主要从事颌面外科的研究。

1广州市第八人民医院普通外科

第一作者：朱欠元(1967-)，男，教授，主任医师，主要从事耳鼻咽喉疾病的研究。

Killing effect of IL-12 recombinant retrovirus transfected dendritic cells in nasopharyngeal carcinoma cells

ZHU Qian-Yuan,ZENG Chang-Ai,XIAO Fan,etal.

Department of Otorhinolaryngology,Clinic Medical College,Jinggangshan University,Ji'an 343000，Jiangxi,China

Abstract【】ObjectiveIn vitro cytotoxicity evaluation of recombinant IL-12 retrovirus transfected dendritic cells in nasopharyngeal carcinoma cells.MethodsRecombinant IL-12 in vitro recombinant retroviral vector was constructed,dendritic cells(DC) were transfected,the culture supernatant was collected,the secretion level of ELISA in supernatant was detected by IL-12,IFN-γ. In nasopharyngeal carcinoma CNE-2 cells,cytotoxic T lymphocyte(CTL) was tested.ResultsThe construction of mIL-containing 12 recombinant retrovirus was succeeded;IL-12 gene modified DC significantly induced IL-12 and IFN-γ secretion(P<0.01). CTL and its supernatant had significant killing effect,compared with that of non transfected DC group(P<0.01).ConclusionsIL-12 gene modified DC could significantly induce IFN-γ secretion and enhance the killing effectiveness of the induction of specific CTL on tumor.

【Key words】IL-12 gene;Dendritic cell;Nasopharyngeal carcinoma

近年来，肿瘤基因治疗成为研究热点。白细胞介素(IL)-12是肿瘤基因治疗细胞因子之一，已用于多种肿瘤的临床试验治疗〔1～4〕，在抗肿瘤基因治疗中有一定的应用价值。本研究探讨体外构建IL-12重组逆转录病毒对鼻咽癌细胞CNE-2的杀伤作用，为进一步开展靶向鼻咽癌基因疗法奠定实验基础。

1材料和方法

1.1材料RPMI1640，Lipofectamine，胎牛血清，聚凝胺购自Gibco公司；G418购自Sigma公司；限制性内切酶及小鼠IL-12p70购自TaKaRa公司；ELISA检测试剂盒购于晶美公司；细胞毒性分析试剂盒购于Promega公司；mIL-12基因真核表达载体、DH5α大肠杆菌和人鼻咽癌细胞株CNE-2由中山大学分子医学中心提供；PA317细胞、NIH3T3成纤维细胞、人外周血的树突细胞和淋巴细胞由广州市第八人民医院李宝金博士提供。

1.2方法

1.2.1IL-12基因的扩增和鉴定将含IL-12基因转化DH5α感受态细菌进行扩增，碱裂解法提取菌液中质粒，限制性内切酶酶切质粒鉴定保存备用。

1.2.2Lipofectamine脂质体转染选择生长良好的PA317，用胰蛋白酶消化后接种在6孔板内，置37℃、5%CO2培养箱内培养。采用Lipofectamine脂质体介导法将质粒IL-12转染包装，通过含G418的细胞培养液进行筛选，3 w后抗性克隆形成移至24孔板继续培养。

1.2.3重组逆转录病毒液的制备及病毒滴度测定用不含G418的培养液置37℃、5%CO2培养箱内培养上述抗G418的克隆细胞株，反复培养收集各代病毒液进行浓缩与保存，NIH3T3法测定重组逆转录病毒的滴度。

1.2.4树突细胞体外诱导培养及转染致敏鼻咽癌患者外周血中收集单个核细胞，调节细胞浓度6孔板上进行贴壁，去除悬浮的淋巴细胞，留下树突细胞并加入含IL-4(20 ng/ml)、GM-CSF(100 ng/ml)、和10%胎牛血清的RPMI1640培养液培养。PA317-IL-12进行转染，48 h收集培养上清液，ELISA法检测上清液中IL-12、干扰素(IFN)-γ的分泌量。

1.2.5细胞毒T淋巴细胞(CTL)细胞毒活性测定按试剂盒有关说明，以经IL-12转染树突细胞培养上清液为杀伤因子，靶细胞为鼻咽癌细胞CNE-2，进行细胞毒实验。对照组为未转染IL-12基因的DC组。

1.3统计学分析采用SPSS10.0软件，多组间比较行单因素方差分析，两两比较行LSD-t检验。

2结果

2.1IL-12质粒扩增、鉴定IL-12质粒被NotⅠ酶切出约11 kb的线性DNA，NotⅠ+XhoⅠ切出包含p35和p40的2.4 kb小片段，以BamHⅠ+EcoRⅠ切出四个片段(图1)。酶切鉴定结果均与所提供的资料相符。

M：λDNA/Eco911；1：IL-12；2：Bgl Ⅱ;3：XhoⅠ;4：BamHⅠ+EcoRⅠ;5：BamHⅠ+Hind Ⅲ;6：NotⅠ+XhoⅠ 图1　IL-12酶切鉴定结果

2.2活性检测树突细胞经IL-12基因修饰后，48 h分泌高水

平IL-12〔(23.65±4.51)pg/L〕及IFN-γ〔(726.22±28.23)pg/ml〕，与未转染DC组〔(7.42±2.75)pg/L,(79.46±2.98)pg/L〕比较有统计学意义(P<0.01)，DC-IL-12诱导的CTL及其上清液对鼻咽癌细胞CNE-2细胞均有显著杀伤作用，分别为(82.43±8.7)%和(57.4±4.3)%，与未转染DC组〔(76.45±8.5)%,(18.23±5.3)%〕比较有显著性差异(P<0.01)。

3讨论

IL-12作为细胞因子和免疫调节因子对肿瘤有直接对抗作用，在原发性、继发性肿瘤的免疫反应中均起重要作用〔5，6〕。IL-12结构独特，由异二聚体构成，须借助二硫键将p35、p40两个亚基共价结合为75 kD糖蛋白链发挥作用。传统获取IL-12活性链方法是将编码p35、p40的基因共同转染靶细胞，但难以控制p35、p40的等量表达，常常有p40高表达，因而降低IL-12的整体生物学活性〔7〕。本研究通过单连IL-12表达质粒，连接p35、p40多顺反子序列IRES以确保两个亚基同时转录，更有利于IL-12肽链具有生物活性。树突细胞是体内功能强大的抗原呈递细胞，IL-12主要来源于树突细胞的分泌。本研究采用基因转染使鼻咽癌患者外周血来源的树突细胞获得可表达IL-12的基因，使树突细胞能在呈递肿瘤抗原的同时高水平地分泌IL-12及IFN-γ。结果表明，IL-12基因修饰DC可以显著增强其诱导同源T淋巴细胞产生特异性抗鼻咽癌免疫的能力，为鼻咽癌的基因靶向治疗奠定基础。

4参考文献

1Marchi LH，Paschoalin T，Travassos LR，etal.Gene therapy with interleukin-10 receptor and interleukin-12 induces a protective interferon-γ-dependent response against B16F10-Nex2 melanoma〔J〕.Cancer Gene Ther，2011；18(2)：110-22.

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5Engel MA，Neurath MF.Anticancer properties of the IL-12 family-focus on colorectal cancer〔J〕.Curr Med Chem，2010；17(29)：3303-8.

6Vecchio MD，Bajetta E，Canova S，etal.Interleukin-12：Biological properties and clinical application〔J〕.Clin Cancer Res，2007；13(16)：4677-985.

7Schoenhaut DS，Chua AO，Wolitaky AG，etal.Cloning and expression of murine IL-12〔J〕.J Immunol,1992；148(11)：3433-40.

〔2014-08-11修回〕

(编辑李相军)