灵芝酸对锂-匹鲁卡品致痫大鼠海马神经元的保护作用

灵芝酸对锂-匹鲁卡品致痫大鼠海马神经元的保护作用

王丽欣刘蕾刘君星马小茹王芳芳梁衍锋吴佳梅王淑秋齐亚灵

(佳木斯大学基础医学院病理生理学教研室，黑龙江佳木斯154007)

摘要〔〕目的观察灵芝酸对氯化锂-匹鲁卡品致痫大鼠海马神经元p-Akt、Akt蛋白表达的影响，并通过应用wortmannin阻断PI3K/Akt通路，探讨灵芝酸是否具有抗癫痫作用及其作用机制。方法选取雄性SD大鼠50只，随机分为5组(n=10)，A组：生理盐水对照组，B组：癫痫模型组，C组：灵芝酸干预组，D组：wortmannin抑制剂组，E组：二甲基亚砜(DMSO)对照组。每组给予相应药后，对大鼠进行行为学观察、HE染色法检测海马神经元细胞形态学变化，免疫组化法检测各组大鼠海马区p-Akt、Akt蛋白表达。结果与A组相比，B、C、D、E组p-Akt、Akt的表达量相对较高(P<0.01)；灵芝酸干预后，C、D、E组p-Akt、Akt的表达量明显比B组增高(P<0.05)；PI3K/Akt通路被阻断后，C、E两组p-Akt、Akt的表达量明显比D组增高(P<0.05)。结论灵芝酸对海马神经元具有一定的保护作用，并且其机制与PI3K/Akt通路的活化并影响其下游蛋白的表达有关。

关键词〔〕灵芝酸；癫痫；PI3K/AKT；p-Akt；Akt

中图分类号〔〕R285.5〔文献标识码〕A〔

基金项目：佳木斯大学研究生科技创新项目(LZZ2014_004)

通讯作者：王淑秋(1957-)，女，教授，硕士生导师，主要从事神经免疫内分泌的病理生理学研究。

齐亚灵(1967-)，女，医学博士，教授，博士生导师，主要从事中药抗衰老研究。

第一作者：王丽欣(1988-)，女，在读硕士，主要从事癫痫发病机制及中药治疗研究。

癫痫主要是由于大脑一过性放电引起的发作性意识丧失〔1，2〕，其病理改变是海马神经元的损伤。灵芝酸作为灵芝的精华，在20世纪80年代就被分离并纯化 ，并证实其中含有的有效成分可对临床上多种常见疾病有防治功效，但是关于灵芝酸对癫痫的防治方面罕有报道。本实验主要通过给予癫痫模型大鼠腹腔注射灵芝酸，并通过PI3K/Akt通路阻断剂wortmannin干预致痫大鼠，观察大鼠海马区Akt、磷酸化Akt(P-Alct)的表达变化，探讨灵芝酸对癫痫大鼠的海马神经元是否具有保护作用。

1材料与方法

1.1实验材料SD大鼠(大连医科大学实验动物中心提供)；灵芝酸(大连美仑生物技术有限公司)；p-Akt、Akt抗体(美国santa cruz生物技术公司)；免疫组化试剂盒、DAB显色剂(武汉博士德公司)；BI-2000医学图像分析系统(成都泰盟生物科技公司)。

1.2分组与给药健康雄性SD大鼠50只，体重(180±20)g，随机分为5组(n=10)，A组：对照组，腹腔注射与氯化锂等量的生理盐水，20 h后经腹腔注射与灵芝酸等量的生理盐水，30 min 后注射与硫酸阿托品等量的生理盐水，30 min后注射与匹鲁卡品等量的生理盐水。B组：癫痫模型组，大鼠腹腔注射氯化锂(3 mmol/kg)预处理，20 h后腹腔注射与灵芝酸等量的生理盐水，60 min后腹腔注射匹鲁卡品(80 mg/kg)，在匹鲁卡品腹腔注射前30 min给予皮下注射硫酸阿托品(1 mg/kg)，以拮抗匹鲁卡品导致的外周胆碱能反应。C：灵芝酸干预组，大鼠腹腔注射氯化锂(3 mmol/kg)预处理，20 h后腹腔注射灵芝酸(10 mg/kg)，60 min后腹腔注射匹鲁卡品(80 mg/kg)，在匹鲁卡品腹腔注射前30 min给予皮下注射硫酸阿托品(1 mg/kg)，以拮抗匹鲁卡品导致的外周胆碱能反应。D组：wortmannin抑制剂组，大鼠腹腔注射氯化锂(3 mmol/kg)预处理，20 h后腹腔注射灵芝酸(10 mg/kg)，60 min后腹腔注射匹鲁卡品(80 mg/kg)，在匹鲁卡品腹腔注射前30 min给予皮下注射硫酸阿托品(1 mg/kg)，以拮抗匹鲁卡品导致的外周胆碱能反应。灵芝酸注射前60 min腹腔注射wortmannin(1 mg/kg)。E组：二甲基亚砜(DMSO)对照组，大鼠腹腔注射氯化锂(3 mmol/kg)预处理，20 h后腹腔注射灵芝酸(10 mg/kg)，60 min后腹腔注射匹鲁卡品(80 mg/kg)，在匹鲁卡品腹腔注射前30 min给予皮下注射硫酸阿托品(1 mg/kg)，以拮抗匹鲁卡品导致的外周胆碱能反应。灵芝酸注射前60 min腹腔注射DMSO(0.5 mg/kg)。匹鲁卡品注射后大鼠出现Ⅳ、Ⅴ级发作，并且持续30 min以上全身性惊厥者视为造模成功。癫痫发作1 h后根据分组情况腹腔注射10%水合氯醛(350 mg/kg)终止发作，注射止痉剂30 min仍没有终止发作，可原剂量重复注射1次。终止发作后6 h取材。

1.3取材与标本制备癫痫终止后6 h给予水合氯醛过量麻醉大鼠，眼科剪刀开胸后分离心包，找到左心室，动脉导管尖端于心尖部行主动脉插管，剪开右心耳，以便血液及灌注液流出。先注入0.9%生理盐水约50 ml，待心耳开口流出透明液体时换为4%多聚甲醛50 ml灌流固定大鼠，大鼠出现抽搐时方可开颅取脑，并置于甲醛溶液中放入4℃冰箱二次固定。24 h后去海马部行石蜡包埋，切片机冠状连续切片，切至所需海马组织，每片厚度为5 μm，放入恒温干燥箱中8 h后分别进行HE及免疫组化染色。

1.4海马组织病理学观察①HE染色。切片二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水，常规苏木素、伊红染色，透明，封片，光镜下观察海马区细胞结构。②免疫组织化学染色将切片经二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水，抗原热修复，滴加5%BSA封闭液37℃孵育20 min，加入p-Akt、Akt一抗4℃过夜，次日加入二抗、SABC、DAB显色剂，最后用苏木素轻度复染，用PBS代替一抗作为阴性对照。镜下观察海马神经细胞中p-Akt及Akt蛋白的表达。每一标本随机取3张切片，每张切片随机取5个不重复的视野，分别对染色的阳性细胞计数，然后取3张切片阳性细胞数的均值作为该标本结果，以每组5例样本观察结果的平均值作为每组的实验结果。

1.5统计学方法应用SPSS17.0软件行单因素方差分析。

2结果

2.1大鼠行为学观察除A组外，各组大鼠基本达到Ⅳ级以上癫痫发作水平。表现为后肢站立、前肢阵挛；四肢抽搐并跌倒、旋转，并且持续发作30 min以上，其中死亡13只，未达发作标准5只，均予以随机替换补充。

2.2HE染色结果光镜下可见A组大鼠海马CA1区及CA3区神经元呈多层分布，椎体细胞及颗粒细胞排列紧密，形态正常，胞体呈圆形或椭圆形，细胞树突稠密，侧支丰富。B组神经元数目明显减少，排列紊乱，胞体变小甚至破裂，核固缩，神经元发生变形。B组较C、D、E组海马神经元变性、坏死的数量和程度要重，并且D组损伤的程度较C组和E组重。见图1。

2.3免疫组化结果两种蛋白均在胞质中表达，胞膜和胞核仅有少量表达。A组胞质中偶有棕黄色颗粒分布。见图2。其余四组中p-Akt、Akt的阳性细胞数均显著多于A组(P<0.01)，胞核中偶见棕黄色颗粒。C、D、E组中两种蛋白的阳性细胞数明显比B组增多(P<0.05)。且C、E组中两种蛋白的阳性细胞数较D组增多(P<0.05)；C组中两种蛋白的阳性细胞数虽多于E组，但无统计学差异(P>0.05)。见表1。

图1　各组海马CA1区神经元(HE，×200)

图2　海马CA1区Akt、p-Akt蛋白表达(SABC，×200)

表1　各组大鼠海马区p-Akt、Akt阳性细胞计数

与A组相比：1)P<0.01；与B组相比：2)P<0.05；与D组相比：3)P<0.05

3讨论

到目前为止主要还是应用抗癫痫药物来控制癫痫发作，手术治疗为辅，但无论是药物治疗还是手术治疗都会对患者造成一定程度的不良影响，灵芝是一种珍贵的天然药用真菌，其中主要含有三萜类、酶类及微量元素等近千种化合物〔3〕，其中三萜类、多糖类等具有生物学活性的成分已被分离、提取。最近研究发现，灵芝在抑制炎症反应〔4〕、抗肿瘤〔5〕及调节人体糖代谢〔6〕等方面都发挥着一定功效，并且灵芝酸还可通过降低痫样放电海马神经元中ERK1/2的磷酸化水平从而达到保护海马神经元的作用〔7〕。

PI3K/Akt信号通路是人体内重要的信号传导通路，已被证实在多种疾病的发生、发展中都发挥着重要的作用，而p-Akt与Akt作为其通路中重要的下游蛋白，不仅可以促进神经元的存活还具有一定的抗凋亡作用〔8〕。Wortmannin作为PI3K/Akt信号通路的抑制剂，可抑制p-Akt与Akt的表达。本实验说明灵芝酸对海马神经元具有一定的保护作用。灵芝酸是通过PI3K/Akt途径对海马神经元起到保护作用的，其作用机制与PI3K/Akt通路有关，并在应用wortmannin后更加证实了这一点，这为以后抗癫痫药物的研究提供了新的靶点。

4参考文献

1Leppik IE.Wanted： a global campaign against epilepsy〔J〕.Lancet，2012;380(9848)：1121.

2Nadler JV.The recurrent mossy fiber pathway of the epileptic brain〔J〕.Neurochem Res，2003;28(11)：1649-58.

3蒋丽，黄远英，殷光玲.灵芝孢子油免疫调节作用的研究〔J〕.现代食品科技，2013;29(3)：531-3，542.

4李仲娟，杨朝令，杨细凤，等.灵芝酸G对FcεR1α~+肥大细胞的活性影响〔J〕.时珍国医国药，2014;25(9)：2101-2.

5王健，杨元帅，王钢，等.灵芝酸抗癌机制的分子模拟研究〔J〕.沈阳药科大学学报，2012;29(11)：887-92.

6金德宽.灵芝酸对人体糖代谢调节作用的研究〔J〕.食品研究与开发，2012;33(11)：202-7.

7栾倩，刘蕾，刘君星，等.灵芝酸对痫样放电海马神经元ERK1/2磷酸化水平的影响〔J〕.黑龙江医药科学，2014;37(2)：1-3.

8史志勤，王维平，于江华，等.重组人红细胞生成素经PI3K/Akt途径对大鼠癫痫持续状态诱导的神经元凋亡的保护作用〔J〕.中国组织化学与细胞化学杂志，2009;18(1)：94-102.

〔2013-12-17修回〕

(编辑苑云杰)