SD大鼠肺成纤维细胞的原代培养及分离纯化

SD大鼠肺成纤维细胞的原代培养及分离纯化

何爱明1李晓晖1李岱2

(福建师范大学福清校区生化系，福建福清350300)

摘要〔〕目的建立大鼠肺成纤维细胞的体外高效稳定的培养方法。方法取成年SD大鼠，采用差速贴壁法纯化与胰酶反复消化法传代，得到纯度更高产量更多的肺成纤维细胞。所得细胞采用免疫细胞化学方法加以鉴定，且进行生长曲线测定。结果肺成纤维细胞纯化率可达99.3%，细胞增殖快,生长良好，产量大。结论成功建立了肺成纤维细胞纯化与传代的方法,适用于细胞水平上的间质性肺病发病机制的研究。

关键词〔〕肺成纤维细胞;原代培养;纯化

中图分类号〔〕R33〔文献标识码〕A〔

基金项目：国家青年科学

通讯作者：李岱(1982-)，男，博士后，助理研究员，主要从事分子药理学研究。

1中南大学药学院药理系2中南大学湘雅医院药剂科

第一作者：何爱明(1967-)，女，硕士，副教授，主要从事呼吸药理学研究。

Primary culture and isolation and purification of SD rat lung fibroblasts

HE Ai-Ming,LI Xiao-Hui,LI Dai.

Department of Biochemistry, Fuqing Campus, Fujian Normal University, Fuqing 350300, Fujian, China

Abstract【】ObjectiveTo establish an efficient and stable culture method of rat lung fibroblasts in vitro.MethodsThe more purified and more production lung fibroblasts were obtained from adult Sprague Dawley rats isolated by improved velocity sedimentation adherence method and repeated digestion method.The cells were identified by immunochemical stain to determine the growth curve.ResultsThe purification rate of lung fibroblasts was 99.3% and they showed strong proliferative ability, grew well and more production.ConclusionsThe purification and subculture technique for lung fibroblast is developed successfully, which is useful to explore the pathologic mechanisms of interstitial lung disease in cellular level.

【Key words】Lung fibroblast;Primary culture;Purification

肺成纤维细胞不仅是重要的间质细胞，也是活跃的分泌细胞，并表现出免疫炎症细胞的特征。它可合成胶原蛋白、弹性蛋白等组织基质成分，合成基质金属蛋白酶和组织型金属蛋白酶抑制物，通过调节细胞外基质代谢，参与组织重建。体外成功培养肺成纤维细胞是研究肺部疾病如支气管哮喘、慢性阻塞性肺疾病、肺纤维化等的重要手段和工具。如何建立一种较简单易行、经济实惠、高单细胞收率、高纯度、高存活率的培养方法,仍是肺成纤维细胞培养模型制作中的关键问题。本实验借鉴前人的经验基础上,采用改良的方法培养出纯度较高、活力较强的SD大鼠肺成纤维细胞。

1材料与方法

1.1材料、动物及试剂与仪器雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，SPF级，体重250 g，中南大学实验动物学部提供。DMEM高糖培养基(美国Hyclone公司)、胎牛血清(天津灏阳生物技术有限公司)、胰蛋白酶(美国Invitogen公司)、小鼠抗大鼠Vimentin 单克隆抗体(美国Abcam公司)、山羊抗鼠HRP 标记二抗(美国Santa Cruz公司)、DAB显示剂(美国Vector公司)。CO2细胞培养箱(FORMA3111，美国Thermo公司)、高性能超净工作台(上海瑞仰净化装备有限公司)、倒置相差显微镜(1×70型，日本Nikon公司)、移液器(德国Eppendorf公司)。

1.2方法

1.2.1肺成纤维细胞原代培养取250 g SPF级雄性SD大鼠1只，10%水合氯醛5 mL/kg腹腔注射麻醉，分离颈总动脉，剪断放血。大鼠移入超净台，开胸取肺，去除肺组织表面胸膜，剪切距离肺周边1 mm 内的肺组织，并将其放入玻璃培养皿。用灭菌的PBS液反复冲洗，去除血液及漂浮的结缔组织，直至PBS 液变为澄清。用手术剪将周边肺组织反复剪切成1 mm×1 mm×1 mm大小的组织块，用含10%胎牛血清的DMEM浸润，然后用眼科弯镊小心勾取肺组织块，均匀贴入25 cm2细胞培养瓶一面，组织块之间距离约为1 cm，将细胞培养瓶放入37℃ 5%CO2湿度为95%的细胞培养箱内培养2 h后，待组织小块贴附于培养瓶后，取出培养瓶，沿培养瓶无细胞一面小心加入含10%胎牛血清的DMEM 培养液5 ml。培养瓶放回细胞培养箱，小心将培养瓶慢慢平放，使组织小块完全浸入培养液中，继续静置培养96 h，细胞从组织块周围完全游出后，用镊子将组织块轻轻取下，此后细胞每隔48 h换液1次，细胞生长至接近完全融合成细胞单层时，进行传代。

1.2.2 肺成纤维细胞传代培养用0.25%胰蛋白酶消化2 h，观察到瓶底大部分细胞开始回缩后，倾倒胰蛋白酶，加入培养基中止消化，用玻璃管小心吹下细胞，未吹下的细胞再次用胰酶进行消化，如此反复，使用胰酶的总时间不超过5 min。以1∶2的比例传代，传代时利用差时贴壁法，即在传代时将所得的混合细胞悬液，接种在培养瓶中，静置于培养箱2 h后，轻轻振摇，倾出尚未贴壁的混杂细胞，进行下一代的培养。每隔2 d换液1次，待细胞铺满瓶底后再用同样的方法进行传代。实验选用第3~6代细胞。

1.3 肺成纤维细胞的鉴定

1.3.1 形态学鉴定将培养过程中不同阶段的肺成纤维细胞置于倒置显微镜下观察细胞形态。

1.3.2 波形蛋白免疫细胞化学染色将第3代细胞种在6孔板中进行培养，待细胞融合70%后，按试剂盒说明书进行免疫细胞化学染色。

1.3.3 纯度鉴定以胞质出现棕黄色丝状为阳性信号,计算每孔5个不重叠视野(×100),分别计数每个视野下阳性细胞数所占总细胞数的百分比，计算其平均数。

1.3.4 细胞的生长曲线测定将第3代成纤维细胞消化稀释,以2×104/ml个细胞接种于12 孔培养板,每孔接种1 ml,于37℃ 5%CO2湿度为95%的细胞培养箱培养,每隔24 h收集3孔细胞并计数,分别取其平均值,每3天换液1次,连续计数7 d后绘制生长曲线。

2结果

2.1 形态观察组织块接种入培养瓶后，12 h内即可见组织块周围有细胞和组织碎片逸出，并围绕组织块形成逸出带，12 h后逐渐有少量细胞逸出。72 h见有细胞逸出并逐渐伸展呈梭形。第6天左右梭形细胞在局部融合成片，与其他形态细胞形成界限分明的隔离带，呈接触抑制现象。此后梭形细胞逐渐在培养瓶内占据优势，覆盖培养瓶大部分面积，7 d左右细胞接近完全融合。传第3代此时细胞呈长梭形、条索状、多角形、漩涡状等，见图1。

2.2 免疫细胞化学鉴定及纯度鉴定波形蛋白染色可见视野内细胞几乎均呈阳性表达(见图2)。传到第4代的肺成纤维细胞阳性率达99.3%。

2.3 生长曲线第3代肺成纤维细胞以2×104/ml接种于12孔培养板,细胞于第6天长满，于第1，2，3，4，5，6，7天细胞数分别为2×104、2.3×104、3×104、4×104、5×105、6×104、6×104个。

培养12 h(×400)

培养72 h(× 400)

培养第6天(×100)

第3代细胞(×100)

图1肺成纤维细胞形态观察

图2　第3代肺成纤维的波形蛋白鉴定(×100)

3讨论

肺组织中有支气管、血管、神经伴行，细胞数量和种类多，包括上皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞、软骨细胞、巨噬细胞、血管内皮细胞、血细胞、神经细胞等多种细胞，经组织块贴壁法培养，会混杂有多种细胞，但成纤维细胞贴壁速度快，仅仅需40 min左右，首先吸附在瓶壁上〔1〕,本实验利用差速贴壁法，即在传代时隔2 h更换培养液，经2~3次贴壁选择后，贴附几乎是成纤维细胞，再利用成纤维细胞脱壁也快且对酶性分离敏感的特点，采用0.25%胰蛋白酶分离进行传代，传至第4代时纯度可达99.3%。

成纤维细胞中间丝的结构蛋白为波形蛋白，不同于上皮细胞的角蛋白,也不同于肌细胞的桥连蛋白,成为不同种类细胞分类鉴定的相对特异性标志〔2〕，本研究免疫细胞化学鉴定结果提示所培养的细胞波形蛋白染色阳性表达，从而证明了该细胞为成纤维细胞。就生长曲线看，在培养1~2 d时就进入指数分裂期，且指数分裂期的持续时间较长达4 d。本实验使用的方法进行了一些改良，用差速贴壁法与反复消化法，所获得的肺成纤维细胞具有较强的分裂增殖能力,适应性强,传代周期短，易培养，性状稳定，纯度高，产量大等特点，可用于细胞水平上研究间质性肺病的发病机制。

参考文献4

1祝华平,常立文,李文斌，等.胎鼠肺细胞的分离纯化及原代培养〔J〕.华中科技大学学报(医学版),2003;32(6):597-600.

2杨志明.组织工程学〔M〕.北京:化学工业出版社,2002:155-8.

〔2013-12-03修回〕

(编辑赵慧玲/曹梦园)