山茱萸多糖对衰老模型小鼠肝组织SIRT1和p53基因表达的影响

山茱萸多糖对衰老模型小鼠肝组织SIRT1和p53基因表达的影响

李晶欧芹江旭东王迪迪朴金花

(佳木斯大学基础医学院生物化学教研室，黑龙江佳木斯154007)

摘要〔〕目的研究山茱萸多糖对衰老模型小鼠肝细胞SIRT1和p53基因表达的影响。方法采用半定量RT-PCR法测定小鼠肝组织SIRT1 mRNA和p53 mRNA的表达，并观察山茱萸多糖对其影响。结果与青年对照组相比，衰老模型组小鼠p53 mRNA表达增高，SIRT1 mRNA表达降低(P<0.01)。山茱萸多糖可降低p53基因表达(P<0.05)，使SIRT1基因表达增强，但与衰老模型组相比差异无统计学意义(P>0.05)；山茱萸多糖大小剂量组间无明显差异(P>0.05)。结论山茱萸多糖通过影响SIRT1对p53的作用而延缓衰老。

关键词〔〕山茱萸多糖；衰老；p53；SIRT1

中图分类号〔〕R285.5〔文献标识码〕A〔

基金项目：黑龙江省卫生厅课题(2010-483)

通讯作者：朴金花(1974-)，女，副教授，硕士，主要从事衰老与抗衰老分子机制的研究。

第一作者：李晶(1975-)，女，硕士，副教授，主要从事衰老与抗衰老分子机制的研究。

衰老是一个复杂、多因素共同调控的生理过程，其发生机制是否受基因调控目前还不十分清楚。有研究显示，当热量限制后，真菌、线虫、果蝇甚至大鼠等动物的寿命可明显延长，这种作用和组蛋白去乙酰化酶-sirtuin蛋白家族有关〔1〕。沉默信息调节因子1(SIRT1)是哺乳动物该家族成员中研究最多的一种，是调节生物体衰老进程的一个重要基因，其基本活性是依赖NAD+的去乙酰化酶，在调节基因表达、细胞凋亡、代谢和老化过程中发挥重要作用〔2〕。在氧化应激条件下，SIRT1可通过对FOXO3和p53等的调节，促进细胞在氧化应激条件下的存活，提示可能有延长细胞寿命的作用〔3〕。Sirtuin家族由于具有调控多种生理过程的功能，使其成为备受关注的治疗代谢和衰老相关疾病的潜在靶点。山茱萸多糖可通过提高机体抗氧化能力、抑制脂质过氧化、提高老化相关酶活性发挥抗衰老作用。本实验分析山茱萸多糖对衰老小鼠肝组织SIRT1和p53基因表达的影响，探讨山茱萸多糖抗衰老作用的机制是否与SIRT1的表达有关。

1材料与方法

1.1药品及实验动物选用Wistar 小鼠由佳木斯大学实验动物中心提供(许可证号：SYXK黑20030014)。山茱萸多糖购自宝鸡市方晟生物开发有限公司，经佳木斯大学药学院鉴定。

1.2动物分组及处理将Wistar小鼠100只，雌雄各半，2~3月龄，体重18~22 g，随机分为青年对照组、衰老模型组、山茱萸多糖小剂量组和大剂量组，每组25只(每组小鼠列数在实验过程中有死亡、取材损耗，为保证最终每组个数10只)。各组正常饮食，衰老模型组每日上午颈背注射D-半乳糖(D-gal)(48 mg/kg)，连续45 d，造模成功后经胃给予相当于给药组药量体积的温开水连续30 d；大小剂量给药组除按模型组注射D-gal外，每日分别按0.4和0.2 g/kg体重灌服山茱萸多糖。连续30 d后于末次给药后次日处死小鼠提取肝组织，液氮保存备用。

1.3指标的测定采用Trizol法提取肝组织RNA，核酸蛋白分析仪测定浓度及纯度。采用电泳凝胶成像系统观察RT-PCR法检测p53、SIRT1 mRNA表达水平：cDNA反应体系：引物选择Oligo dT18-Adaptor Primer，5×RNA PCR缓冲液5 μl，无RNA酶水6.5 μl，dNTP混合物4 μl，RNA酶抑制剂0.5 μl，AMV逆转录酶1 μl，Oligo-dT 引物1 μl，RNA样品2 μl，混匀，移入PCR仪，42℃ 60 min;95℃ 5 min;1次循环。PCR反应：采用β-actin和GAPDH作内参，GAPDH引物5＇CTGAATTCGGGCTCTCCAGAACATCATC-3＇，5＇-CAGGATCCCCAGCGTCAAAGGTGGA-3＇(扩增产物302 bp)；β-actin引物 5＇-CTACAATGAGCTG CGCGTGGC-3'，5＇-CAGGTCCAGACGCAGGATGGC3＇(扩增产物242 bp)；p53引物5＇-AAGACAGGCAGACTTTTCGCCACAG-3＇，5＇-AGGCACAAACACGAACCTCAAAG-3＇(扩增产物248 bp)；SIRT1引物5'-GAACCTTTGCCTCATCTACATTTTG-3'，3'-CAAGTA AATAGTCTCAACGGTGGTT-5'(扩增产物393 bp)。94℃ 5 min,1循环，94℃ 40 s，60℃ 45 s，72℃ 45 s；35个循环，72℃ 7 min。PCR产物以凝胶成像系统扫描，以各组中cDNA扩增产物的条带与内参β-actin和GAPDH条带灰度值比值(p53/GAPDH和SIRT1/β-actin)表示mRNA水平。

1.4统计学处理采用SPSS13.0软件进行单因素方差分析及SNK-q检验。

M：Marker 1~4：青年对照组、衰老模型组、山茱萸小剂量组、山茱萸大剂量组，下图同 图1　各组小鼠肝组织p53 mRNA的表达

2结果

与青年对照组相比，衰老模型组SIRT1 mRNA表达下降，p53 mRNA表达显著增高(P<0.01)；与衰老模型组比较，大、小剂量给药组SIRT1 mRNA升高，但差异不显著(P>0.05)；与衰老模型组相比p53 mRNA表达降低(P<0.05)，但两给药组间相比较表达无差别(P>0.05)。见表1，图1，图2。

表1　山茱萸多糖对衰老模型小鼠肝组织 SIRT1和p53

与青年对照组比较：1)P<0.01,与衰老模型组比较：2)P<0.05

图2　各组小鼠肝组织SIRT1 mRNA的表达

3讨论

SIRT1是一种依赖NAD+的Ⅲ类组蛋白去乙酰化酶，在维持基因组的稳定性、细胞分化、衰老、凋亡、DNA损伤修复、有丝分裂调控、抗凋亡等生命活动及能量、内分泌代谢调节中起重要作用，同时在基因沉默、表观遗传学修饰、转录调控及信号转导调节中发挥重要的生物学功能〔4~6〕。SIRT1在一定程度上延长寿命的原因是它升高或降低了转录相关基因的活性，它可以抑制p53引起的细胞凋〔7〕。p53基因是一种与细胞凋亡、癌变、衰老和基因修复相关的重要基因，主要功能是在细胞受到破坏和基因组受到损伤时起到细胞周期的刹车作用。本实验结果说明在细胞处于氧化压力和DNA损伤时p53表达增强，使得p53的C端的多个位点被乙酰化，而p53是SIRT1的一种底物，SIRT1可使p53基因去乙酰化，削弱了p53基因的作用效果，使p53成为无活性形式，进而减少凋亡的可能性并延长细胞寿命。但山茱萸多糖用药组SIRT1 mRNA表达与衰老模型组比较，没有明显差异，可能由于实验条件的限制，未能观察更多数量的动物，样本小不足以观察到显著性差异，有待进一步扩大样本量证实。山茱萸多糖用药组大小两剂量间无明显差异。综上，山茱萸多糖可以通过调控SIRT1对p53基因的表达而发挥抗衰老作用。

参考文献4

1罗兰，高政南，程丽静，等.SIRT1与基因转录〔J〕.中国生物化学与分子生物学报，2007；23(3):187-93.

2吴梦然，张红胜，周洪森.SIRT1与衰老的关系〔J〕.生命的化学，2009；29(2):197-201.

3蔡群芳，周鹏.去乙酰化酶sirtuin研究进展〔J〕.生命科学，2006；18(2)：133-7.

4Easton J，Wei T，Lahti JM，etal.Disruption of the cyclinD/cycIin-dependent kinase/INK4l retinoblastoma protein regulatory pathway in human neuroblastoma〔J〕.Cancer Res，1998；58(12)：2624-32.

5Fong LY，Nguyen VT，Farber JL，etal.Early deregulation of the pl6 ink4a-cyclinDl/cyclin-dependent kinase 4-retinoblastoma pathway in cell proliferation-driven esophageal tumorigenesis in zinc-deficient rats〔J〕.Cancer Res，2000;60 (16):4589-95.

6Serrano M，Beach D,Hannon GJ，etal.A new regulatory motif in cell-cycle control causing specific inhibition of cyclinD/CDK4〔J〕.Nature，1993；366：704-7.

7郭亦琦，施冬云，王君晖.sirt基因家族及其对细胞寿命的调节〔J〕.生物物理学报，2006；26(1)：7-11.

〔2013-09-28修回〕

(编辑赵慧玲/曹梦园)