HSP27在调控人胃癌细胞系5-FU耐药中的作用机制

HSP27在调控人胃癌细胞系5-FU耐药中的作用机制

宋荣峰张慧卿熊彦王艳华万以叶

作者单位:330029 江西省肿瘤医院

【摘要】目的探讨热休克蛋白27(HSP27)在调控人胃癌细胞系5-FU耐药中的作用机制。方法培养人胃癌细胞株HGC27、BGC823、SGC7901、MKN28，采用CCK法筛选5-FU敏感株和耐药株，采用流式细胞仪和western blot 检测4株胃癌细胞株中HSP27表达水平，转染HSP27-siRNA，观察siRNA干扰后5-FU敏感株和耐药株中HSP27蛋白表达，并将两细胞株分别与不同浓度5-Fu共培养，采用CCK法检测细胞的半数抑制浓度(IC50)。结果CCK法显示SGC7901细胞系是4株胃癌细胞中5-Fu相对耐药株，而HCG27是5-Fu相对敏感株。流式细胞仪显示SGC7901细胞株中HSP27表达水平最高为 (72.10±1.89)%，而在HGC27细胞株中的表达水平最低为(22.12±1.33)%，各株表达水平比较差异有统计学意义(P<0.05)。转染HSP27-siRNA 后，各两株细胞HSP27蛋白表达水平均下降明显。与5-Fu共培养后，SGC7901细胞株转染组细胞半数抑制浓度降低，药物敏感性增强，与未转染组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论HSP27参与了SGC7901 5-FU耐药株中的细胞耐药，是诱导细胞多药耐药的重要分子机制，可以作为临床治疗靶点来提高胃癌患者对化疗的敏感性。

【关键词】胃癌；5-FU；HSP27

基金项目：江西省卫生厅一般科技项目(编号：20091213)

通讯作者：宋荣峰

DOI：10.3969/j.issn.1001-5930.2015.10.003

中图分类号：R735.2

收稿日期(2015-04-21修回日期 2015-08-03)

The Mechanism of HSP27 Regulation of 5-FU Resistant in Human Gastric

Cancer Cell Lines

SONGRongfeng,ZHANGHuiqing,XIONGYan，etal.JiangxiCancerHospital,Nanchang,330029

Abstract【】ObjectiveTo investigate the mechanism of HSP27 of 5-FU resistant in human gastric cancer cell lines.MethodsHuman gastric cancer cell lines(HGC27,BGC823,SGC7901,MKN28)were cultured,and the cells which were resistant to 5-FU were selected by CCK assay and flow cytometry.The expression of HSP27 in these cells were detected by Western Blotting.And 2 cell lines were co-cultured with different concentration of 5-Fu,then the half inhibition concentration was detected by CCK assay.ResultsCCK assay showed that SGC7901 cell line was relatively resistant to 5-Fu,and the HCG27 cell line was relatively sensitive to 5-Fu.The flow cytometry results suggested that the expression of HSP27 in the SGC7901 cells was the highest(72.10±1.89)%.Nevertheless,it was the lowest in the HGC27 cells(22.12±1.33)%.After transfection by HSP27-siRNA,the expression levels of HSP27 in two cell lines was significant decreased (P<0.05);however,co-cultured with 5-Fu,the half inhibition concentration of SGC7901 cell lines was decreased,meanwhile the sensitivity to 5-Fu was enhanced.ConclusionHSP27 is involved in the 5-Fu resistance of SGC7901 cells,it induced an important molecular mechanism of multi-drug resistance and could be applied as a therapeutic target in order to increase the sensitivity of chemotherapy.

【Key words】Gastric cancer;5-FU;HSP27

(ThePracticalJournalofCancer,2015,30:1430～1433)

在中国胃癌的发病率和死亡率居高不下，发病率位居第二，死亡率则为第三，是我国恶性肿瘤中危害最为严重的疾病之一。尽管随着胃癌的诊疗水平不断提高，但是大部分胃癌确诊已属晚期，失去手术机会，化疗成为治疗的主要手段[1]。氟尿嘧啶(5-FU)作为目前胃癌化疗的基础用药，其耐药性也越来越受到关注。有研究表明，HSP27在多种肿瘤特别是腺癌起源者中异常高表达，其高表达与肿瘤耐药关系密切。研究证实，HSP27是结肠癌5-FU耐药的新的调节子，但在胃癌细胞中未见相关研究报道[2]。本研究将探索HSP27在人胃癌细胞系5-FU耐药中的调节作用，从而为逆转胃癌5-FU耐药的新途径提供理论依据。

1材料与方法

1.1主要试剂

人胃癌细胞系HGC27、BGC823、SGC7901、MKN28由中国科学院上海生命科学研究院健康科学研究所惠赠，RPMI1640细胞培养液(Gibco公司)，0.5%(质量分数)胰酶-乙二胺四乙酸(Trypsin-EDTA)(Gibco公司)，胎牛血清(Sigma公司)，Cell Counting Kit-8(日本，Dojindo) 兔抗人HSP27多克隆抗体购自Abcam 公司。

1.2细胞培养

HGC27、BGC823、SGC7901、MKN28 4株胃癌细胞分别培养于含10%胎牛血清的RPMIl640培养基中，并置于5%CO2、37 ℃条件下的培养箱中进行培养。

1.3细胞增殖的CCK检测

将对数生长期的4株胃癌细胞经0.5%胰酶消化，细胞计数，制成细胞悬液，将细胞浓度为1×104/ml接种于96孔培养板，每孔200 ul进行培养，待细胞活性恢复，加入5-Fu，药物浓度为0 mg/L、1 mg/L、5 mg/L、 10 mg/L、15 mg/L、20 mg/L，每个浓度设计3复孔，置于37 ℃培养箱中培养72 h后，于每孔加入10 μl的CCK-8，再置于培养箱中培养4 h，测定450 nm波长吸光度值，绘制细胞生长曲线，实验重复3次。

1.4流式细胞仪检测HSP27的表达

取对数生长期的HGC27、BGC823、SGC7901、MKN28 4株胃癌细胞，PBS洗净后分别加入FITC标记的P-gp抗体40 μl，混匀，避光，4 ℃孵育30 min。PBS终止反应，离心1 000 r/min，4 ℃ 离心5 min，弃上清，PBS洗2次。流式细胞仪检测FITC荧光强度，Cell-quest软件进行5-Fu耐药株、5-Fu敏感株的HSP27表达分析。

1.5siRNA干扰和细胞转染

HSP siRNA由上海生工合成，HSP siRNA序列(5'-UAGCCAUGCUCGUCCUGCCUU-3′)。应用Lipofectamine TM2000转染剂并按照说明书进行转染。将2×104cells/ml的耐药株胃癌细胞SGC-7901和敏感细胞株HCG27分别接种于6孔板，每株胃癌细胞分为3组：空白对照组、转染Lipofectamine组、转染HSP-siRNA组，在37 ℃、50 ml条件下孵育，孵育4 h，24 h收集细胞。

1.6Western bolt检测转染后siRNA干扰后胃癌细胞中HSP蛋白的表达

分别收集3组经处理的耐药株及敏感株胃癌细胞(1×107)：空白对照组(Non-control)、转染Lipofectamine组(Li-control)及转染HSP-siRNA组(siRNA group),加入适量含有蛋白酶抑制剂的细胞裂解液RIPA。离心12 000 rpm 4 ℃ 10 min，取上清，BCA 法蛋白定量。计算含50 ng蛋白的溶液体积即为上样量,经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，转膜至硝酸纤维素膜(Millipore公司产品)后封闭,加入一抗(HSP抗体,P-pg抗体,Santa C ruz公司产品)4 ℃孵育过夜,加入二抗(辣根过氧化物酶标记的兔抗羊IgG,Zymed 公司产品)室温下孵育1～2 h；ECL显影，暗室中X 光胶片曝光1 min或5 min，放入冲片机冲洗。胶片扫描，用凝胶图象处理系统分析目标带的分子量和净光密度值。以曝光条带的强弱分析HSP27蛋白表达的高低。同时设立β-actin(Santa C ruz公司产品)为内对照。

2结果

2.1CCK检测5-Fu对不同胃癌细胞株生长的抑制作用

不同浓度的5-Fu(0 mg/L、1 mg/L、5 mg/L、10 mg/L、15 mg/L、20 mg/L)分别用于作用HGC27、BGC823、SGC7901、MKN28 4株胃癌细胞72 h，通过绘制生长曲线图(图1)，发现5-Fu对4株胃癌细胞的生长都具有抑制作用，其中对HGC27的抑制效果最显著，IC50为5.85 mg/L；对SGC7901抑制率最低，为17.00 mg/L。

图1　CCK检测5-Fu对不同胃癌细胞株生长的抑制情况

2.2流式细胞仪检测4株胃癌细胞株中HSP27蛋白表达情况

流式细胞仪检测结果表明，4株胃癌细胞株中HSP27表达水平各不相同，在SGC7901中表达水平最为显著为 (72.10±1.89)%，BGC823为(63.92±2.94)%，MKN28中的表达水平为(45.40±2.62)%，在HGC27中的表达水平为(22.12±1.33)%，显著低于5-Fu耐药株SGC7901中HSP27的表达水平，差异有统计学意义(P=0.002)(图2)。

图2　流式细胞仪检测4株胃癌细胞株中HSP27蛋白表达情况

2.3Western bolt检测siRNA干扰后5-Fu胃癌耐药株与敏感株中HSP27的表达

根据CCK检测结果，SGC7901细胞株是4株胃癌细胞中5-Fu相对耐药株，而HCG27是5-Fu相对敏感株，选择SGC7901及HCG27胃癌细胞系作为HSP27 siRNA干扰细胞株，Westerb blot 结果发现，siRNA干扰后细胞株SGC7901和HCG27中HSP27蛋白表达水平均明显下降，灰度扫描显示相对比值分别为(1.375±0.301)和(1.259±0.289)，见图3、图4。

N：空白对照组，C：Lipofectamine转染组，SiRNA:siRNA干扰组

N：空白对照组，C：Lipofectamine转染组，SiRNA:siRNA干扰组

2.4干扰前后SGC7901及HCG27细胞对5-FU敏感性的变化

转染24 h后，与5-Fu共培养后，未转染组SGC7901 和 HGC27的IC50分别为17.24 mg/L和5.78 mg/L，转染组细胞IC50分别为8.54 mg/L和5.12 mg/L，耐药株SGC7901细胞的半数抑制浓度明显降低，药物敏感性增强，与未转染组比较差异有统计学意义(P<0.05)，见图5。

图5　3组SGC7901细胞株的对5-FU敏感性的变化

3讨论

热休克蛋白27是小分子热休克蛋白家族的医院，其具有保护机体生理细胞免受热、毒物、缺氧、自由基等损伤的作用，可促进蛋白质的正确组装和纠正错误的蛋白结构，具有分子伴侣的作用[3-5]。最新研究还发现，HSP27参与了肿瘤细胞的恶性生物学行为，包括促进细胞的增生、分化和抑制肿瘤细胞的凋亡等，具有调节细胞内信号转导的作用[6]，HSP27在多种恶性肿瘤中高表达，且与乳腺癌、子宫内膜癌和胃癌等患者的预后密切相关[7-10]。目前，国内临床上治疗恶性肿瘤的主要措施为化疗和根治性手术治疗等，术前常规化疗可有效缩小肿瘤体积，提高手术的成功率，但部分患者对化疗药物顺铂、5-FU等具有耐药性，国外有学者通过将HSP27 cDNA转染小鼠，获得高表达HSP细胞后发现其对顺铂等具有高抵抗能力[11]。国内学者研究也发现，高表达HSP的肿瘤细胞株对阿霉素具有较高的抵抗作用。大量实验证实了HSP27高表达与肿瘤的化疗耐药等密切相关[12-15]。因此，本研究将探索HSP27在人胃癌细胞系5-FU耐药中的调节作用，从而为逆转胃癌5-FU耐药的新途径提供理论依据。

本研究通过筛选5-FU胃癌细胞株耐药株和敏感株，采用siRNA干扰技术，沉默细胞内HSP27的表达，并与5-FU共培养后关系细胞的半数抑制浓度的变化，结果发现，siRNA干扰后细胞内HSP蛋白表达下降，表明RNA干扰技术成功沉默了HSP27的表达，而与5-FU共培养后，胃癌细胞耐药株SGC7901对5-FU的敏感性增强，半数抑制浓度降低，表明HSP27可以在一定程度上逆转胃癌细胞对5-FU的耐药，增强了维系细胞对5-FU的敏感性。上述结果表明，胃癌细胞内HSP27的表达水平与细胞对化疗药物的敏感性密切相关，HSP27将可作为临床治疗的新靶点。

目前关于HSP27诱导胃癌细胞化疗耐药的机制研究不多，尚无明确结论，化疗药物5-FU主要是通过诱导细胞凋亡发挥抗肿瘤生长的作用[16]。大量研究表明，HSP27可以特异性干扰线粒体途径的胱天蛋白水解酶诱导的凋亡，并可与凋亡蛋白Caspase3结合，而Caspase3 可通过裂解底物PARP使细胞损失对DNA损伤的修复功能，促进凋亡的发生，当HSP27与后者结合后，抑制了凋亡，从而促进了细胞的生长[17-20]，通过从机制上进一步研究HSP27参与肿瘤化疗耐药的可能机制，才能更好地干扰HSP27的表达，为临床提供理论依据。

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(编辑：甘艳)