南极海泥来源抗肿瘤真菌的筛选与鉴定

（中国药科大学生命科学与技术学院，江苏南京210009）

海洋微生物由于资源丰富，在解决用药需求问题的同时具有不破坏生态环境等优点，其生物活性物质的研究已成为国内外研究的热点［1］。特别是海洋真菌因其代谢途径复杂、代谢产物种类繁多而日益受到研究者的重视［2］，是开发抗肿瘤及其它药物的重要资源。海洋真菌次级代谢产物因新颖的骨架结构而具有生物活性的多样性［3］，其抗氧化性、抗菌、抗酪氨酸酶、细胞毒活性或抗肿瘤、醌还原酶诱导和抗疟原虫活性也被广泛研究［4］。目前，已从海洋环境中分离得到多种具有较强细胞毒活性和抗肿瘤活性的天然产物，仅2006～2012年间，就从海洋真菌中分离得到了690个天然产物［4］，其中大多数化合物属于聚酮类，其次为生物碱、萜类以及肽类。这些海洋真菌多属于青霉属和曲霉属，还有不常见的顶头胞属、裸胞壳菌属、附球菌属等。虽然从海洋真菌中分离的抗癌先导化合物进入人体临床试验的数量大幅增加［5］，但这些先导化合物由于结构复杂、合成难度较大，难以满足临床需求［6］。

作者在此对61株分离自南极海泥的海洋真菌进行抗肿瘤活性筛选，以期发现具有潜在应用前景的抗肿瘤活性菌株，并为活性物质的分离奠定基础。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

海泥样品取自南极深海，保存于中国药科大学微生物制药实验室。

MTT（噻唑蓝），Sigma公司；1640培养基、胎牛血清，Giboco公司；二甲基亚砜、乙酸乙酯，分析纯，国药集团化学试剂有限公司；真菌基因组DNA 提取试剂盒，上海生工生物工程有限公司；Taq酶，上海生物工程公司；PCR 引物由上海生物工程公司合成。

SHZ－D（Ⅲ）型循环水式真空泵、HH－S型水浴锅，巩义予华仪器有限责任公司；BS1245型分析天平，北京赛多利斯仪器系统有限责任公司；DHG－9140A 型电热恒温鼓风干燥箱，上海恒科有限公司；CO2培养箱，Excella公司；酶标仪，BIO－TEK 公司；旋转真空蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；SW－CJ－2FD 型超净工作台，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；凝胶成像系统，Bio－Rad公司。

1.2 培养基

分离培养基：马铃薯培养基（取200g马铃薯，煮沸30min，5～8层纱布过滤，滤液补足至1 000mL）中加入葡萄糖1.6%、琼脂2%、海盐1.6%，混合后加入200mg氯霉素。

发酵培养基：葡萄糖3%，可溶性淀粉2%，酵母粉1%，KH2PO42%，海盐2%，MgSO4·7H2O 0.6%。

细胞培养基：1640培养基中加入10%的胎牛血清和1%的双抗。

1.3 肿瘤细胞株

人肝癌HepG－2细胞；人胃癌7901细胞；人结肠癌116细胞。

1.4 方法

1.4.1 菌株的分离

采用平板稀释法，取海泥样品1g，加无菌水10 mL，激烈振荡制备混悬液，逐步稀释制成10－1～10－7梯度溶液，分别涂布于分离平板上，28 ℃倒置培养。观察菌落的形态，挑取形态大小差异较大的菌落，纯化后4 ℃冰箱保存。

1.4.2 乙酸乙酯萃取物的制备

将纯化后的菌体由斜面接种至发酵培养基中，于28 ℃、200r·min－1培养7d，发酵液去除菌丝体，用等体积乙酸乙酯萃取3次，上层有机相于45℃减压浓缩至干，用二甲基亚砜溶解配制成100μg·mL－1的粗品并用0.22μm 微孔滤膜过滤供活性测试。

1.4.3 抗肿瘤活性菌株的筛选

采用MTT 法［7］测试乙酸乙酯萃取物的体外抗肿瘤活性。取对数生长期的细胞，用细胞消化液消化并收集细胞，吹打混匀，记数，配制成5×104个·mL－1的细胞悬液。按每孔180μL 接种于96孔板，并设置阴性对照和空白对照。于37 ℃、5%CO2培养箱中培养24h后加入20μL稀释的乙酸乙酯萃取物，每个浓度设置5 个复孔，继续培养20h。每孔加入20μL MTT，反应4h后取出，吸去上清液，加入150μL 二甲基亚砜溶液，用酶标仪测定590nm 处吸光度，按下式计算抑制率。

1.4.4 活性菌株的鉴定

取适量发酵液，离心，去上清液，将菌丝体在液氮中充分研磨后转入2 mL EP 管中，用真菌基因组DNA 提取试剂盒提取DNA 后，采用真菌通用引物ITS1（5′－TCCGTAGGTGAACCTGCGG－3′）和ITS4（5′－TCCTCCGCTTATTGATATGC－3′）扩增提取的rDNA ITS基因。PCR 反应体系为50μL：模板DNA 5μL、引物ITS1和引物ITS4各1μL、dNTP mixture（2.5mmol·L－1）4μL、10×PCR buffer 5μL、Taq酶5μL；ddH2O 33.5μL。PCR 反应条件为：94 ℃预变性3min；95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸40s，33个循环；72 ℃延伸3min。

PCR 扩增产物的检测：取5μL 扩增产物加1μL 6×上样缓冲溶液，于含溴化乙啶的1% 琼脂糖凝胶上100V 电泳30min，在紫外灯下观察纯化结果。对纯化后产物测序，并与GenBank中已知序列进行比对，以鉴定抗肿瘤活性菌株的归属。

2 结果与讨论

2.1 抗肿瘤活性菌株的初筛

采用MTT 法对分离得到的61株海洋真菌进行活性初筛。分别测定100 μg·mL－1海洋真菌对HepG－2细胞、7901细胞及116细胞的抑制率，结果见表1。

由表1可知：有27株菌对HepG－2细胞抑制率大于60%，占总供试菌株的44.26%；有22株菌对7901细胞具有抑制作用，占总供试菌株的36.07%；有22株菌对116 细胞抑制率大于50%，占总供试菌株的36.07%。

2.2 抗肿瘤活性菌株的复筛

为进一步验证活性菌株的抗肿瘤活性，采用倍比稀释法将初筛中具有较高抗肿瘤活性的9株菌株浓度（μg·mL－1）分别稀释为50、25、12.5、6.25，通过MTT 法测定其在不同浓度下对HepG－2细胞的抑制率，并计算IC50值，结果见表2。

由表2可知，菌株S33、S45发酵液的浓度稀释到6.25μg·mL－1时，抗肿瘤活性仍然很高。于是，又将其浓度（μg·mL－1）稀释至10、5、2.5、1.25、0.625，结果发现菌株S33和S45仍具有很高的抗肿瘤活性，其IC50值分别为3.53μg·mL－1和1.25μg·mL－1。

2.3 抗肿瘤活性菌株的鉴定

对具有较高抗肿瘤活性的菌株S3、S26、S33、S45、S48、S50、S58进行测序，并与GenBank中已知序列进行比对，结果见表3。

由表3 可知，菌株S3 属黑附球菌属，菌株S26、S50属曲霉属，菌株S33、S45属青霉属，菌株S48属蓝状菌属，菌株S58属交链孢真菌属。

3 结论

从南极海泥样品中分离得到61株海洋真菌，先采用MTT 法对其发酵液的乙酸乙酯萃取物进行体外抗肿瘤活性筛选，然后对活性较高的菌株进行鉴定，并进一步测定乙酸乙酯萃取物对HepG－2细胞的IC50值。结果表明：对HepG－2细胞抑制率大于60%的有29株菌，占总供试菌株的47.54%；对7901 细胞具有抑制作用的有22 株菌，占总供试菌株的36.07%；对116细胞抑制率大于50%的有22株菌，占总供试菌株的36.07%；菌株S45的抗肿瘤活性最强，对HepG－2细胞的IC50值为1.25μg·mL－1，经鉴定为青霉属真菌。

表1 抗肿瘤活性菌株对HepG－2细胞、7901细胞及116细胞的抑制率／%Tab.1 Inhibition rate of antitumor active strains against cell HepG－2，cell 7901and cell 116／%

表2 抗肿瘤活性菌株对HepG－2细胞的抑制率及IC50值Tab.2 Inhibition rate and IC50value of antitumor active strains against cell HepG－2

表3 抗肿瘤活性菌株的鉴定Tab.3 Identification of antitumor active strains

［1］张亚鹏，朱伟明，顾谦群，等.源于海洋真菌抗肿瘤活性物质的研究进展［J］.中国海洋药物，2006，25（1）：54－58.

［2］周荣丽，穆军，张翼，等.海洋真菌活性代谢产物最新研究进展［J］.天然产物研究与开发，2008，20（4）：741－747.

［3］BLUNT J W，COPP B R，KEYZERS R A，et al.Marine natural products［J］.Nat Prod Rep，2014，31（2）：160－258.

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［5］LORDAN S，ROSS R P，STANTON C.Marine bioactives as functional food ingredients：Potential to reduce the incidence of chronic diseases［J］.Marine Drugs，2011，9（6）：1056－1100.

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