三氯化铝比色测定火棘总黄酮方法的系统考察

鄢又玉，夏婷，张育，游元，赵春芳，余龙江，*

（1.华中科技大学生命科学与技术学院，湖北武汉430074；2.武汉轻工大学生物与制药工程学院，湖北武汉430023）

三氯化铝比色测定火棘总黄酮方法的系统考察

鄢又玉1，2，夏婷2，张育2，游元2，赵春芳1，余龙江1，*

（1.华中科技大学生命科学与技术学院，湖北武汉430074；2.武汉轻工大学生物与制药工程学院，湖北武汉430023）

探讨以芦丁作为对照品，建立三氯化铝（AlCl3）比色法测定火棘总黄酮含量的最优条件。系统考察了对照品、光照、反应时间及温度、显色剂AlCl3浓度及用量、体系pH、缓冲液用量等因素对总黄酮与AlCl3显色反应的影响。结果表明，AlCl3比色法测定火棘总黄酮含量的最优条件为：1mL适宜浓度的火棘提取液，依次加入2mL pH5.4的醋酸-醋酸钠缓冲液，1mL质量浓度2%AlCl3液，70%乙醇定容至10mL并混匀，不避光条件下30℃反应12min，285 nm测定吸光度。该测定方法具有良好的重复性、稳定性、重现性，回收率。

火棘；总黄酮；芦丁；AlCl3比色法

火棘（P yracantha fortuneana）属于蔷薇科苹果亚科（Maloideane），是一种药食两用常绿野生灌木，在我国共有7个种属，广泛分布于东南、西南和西北部，尤以湖北神农架地区资源最丰富，年均产量在5万t以上[1]。火棘富含黄酮类[2]等天然抗氧化成分，研究表明，黄酮类化合物具有增强记忆[3]、抗衰老[4-5]、抗疲劳[6]、消食健脾[7]、通便润肠、降血脂[8]、抗菌[9]、改善脂蛋白、保护心肌及抗糖尿病等[10]功效。目前，火棘资源在日本、韩国等已开发得相当成功，广泛应用于食品、药品及化妆品[11]等领域，而在中国大陆火棘整体开发力度不够，仅以盆景，果酒[12]，果醋[13]以及果实粗提物低端应用及出口，具有极大的开发潜力，市场前景相当广阔。植物总黄酮的含量测定一般采用直接分光光度法、比色法、高效液相色谱（HPLC）法等[14-18]。直接分光光度法灵敏度低，比色法能提高测定灵敏度，是被《中国药典》所采用的最常见的总黄酮测定方法，其中又以NaNO2-Al（NO3）3-NaOH比色法最常用，但NaNO2-Al（NO3）3-NaOH比色法不能排除邻二酚羟基非黄酮类物质的干扰[19-20]，而火棘中已经报道的很多非黄酮成分如鞣酸、山奈酚及反式肉桂酸等均具有邻二酚羟基[21]，因此，使用该方法专属性不强，不适合于火棘总黄酮的测定。HPLC法测得的结果相对准确，但其所需单体不易得到且所用仪器费用较高，难以满足一般产业化的需求。黄荣[22]及甘秀海[23]等学者对火棘总黄酮含量测定进行了相关研究，前者粗略比较了亚硝酸钠-硝酸铝比色法与AlCl3比色法，且只对AlCl3比色法中体系pH对测定结果的影响进行了初步探讨，并未展开系统而深入的研究；后者肯定了以AlCl3-NaAc为显色体系的紫外分光光度测定法，却对影响含量测定的相关因素只字未提，两篇文章均未给出火棘总黄酮测定的最优参数条件。因此，本课题在他们研究的基础上，采用AlCl3比色法测定火棘总黄酮含量，并对影响测定的相关因素如对照品、体系pH、显色剂浓度及用量、反应时间及温度等展开系统而深入的考察，最终建立了火棘总黄酮含量测定的最优条件。该方法简便可行，具有良好的重现性及稳定性，可作为工业化大规模生产火棘总黄酮含量测定的首选方法之一。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

火棘果，2012年11月中旬采自湖北恩施来凤地区，经华中科技大学植物学博士杨悦鉴定为全缘火棘（Pyracanthaatalantioides（Hance）Stapf）。去离子水，无水乙醇，无水氯化铝，结晶乙酸钠，醋酸等均为分析纯；芦丁对照品，槲皮素对照品：中国药品生物制品检定所。

万分之一分析天平：上海民桥精密科学仪器有限公司；PE-Lambda25紫外-可见光光度计：美国PE公司；DF-101B集热式磁力加热搅拌器：金坛市医疗仪器厂。

1.2 方法

1.2.1 火棘提取物制备

取过20目筛、干燥去籽的火棘果粉末50 g，加入70%乙醇，料液比1∶10（g/mL），80℃水浴加热回流提取2 h，过滤离心后取上清液，以70%乙醇定容至500mL，稀释10倍后作为储备液待用，此时火棘提取物浓度记为10mg/mL。

1.2.2 对照品的选择及最大吸收波长的确定

分别吸取折算后实际浓度0.05mg/mL芦丁、槲皮素溶液各5mL，置于25mL具塞比色管中，依次加入2mL pH5.4的醋酸-醋酸钠缓冲液，2%AlCl3溶液（2 g无水AlCl3，以70%乙醇定容至100mL）10mL，70%乙醇定容，快速混匀后室温静置12min。同时做空白试验，在200 nm～700 nm范围进行全波段扫描，谱图参见图1。

1.2.3 标准曲线的绘制

分别取0.15mg/mL芦丁对照品液0.6、1.0、1.4、1.8、2.2、2.6、3.0mL于10mL具塞比色管中，依次加入2mL pH5.4的醋酸-醋酸钠缓冲液，1mL 2%AlCl3溶液，70%乙醇定容混匀后，30℃静置12min。以不加对照品的溶液作空白对照，在285 nm测吸光度，以芦丁样液浓度C（mg/mL）对吸光度值（A）进行线性回归，绘制标准曲线。

1.2.4 AlCl3法测定火棘总黄酮的影响因素考察

1.2.4.1 显色剂用量

准确移取1mL样品液置于10mL具塞比色管中，分别加入不同量（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5mL）1% AlCl3溶液，混匀，30℃显色反应8min，70%乙醇定容待测；同时作空白对照，在285 nm测吸光度，每个样品重复测3次，取平均值（以下所有测定均同上操作）。以吸光度值对显色剂用量作图，结果参见图2。

1.2.4.2 显色剂浓度

准确移取1mL样品溶液于10mL具塞比色管中，分别加入1m L 1%、2%、3%及4%AlCl3液，其他操作同1.2.4.1，以吸光度值对显色剂用量作图，结果参见图3。

1.2.4.3 显色时间

准确移取1mL样品溶液于10mL具塞比色管中，加入1mL 1%AlCl3溶液，室温分别放置4、8、12、16、20min，70%乙醇定容待测，其他同上操作。以吸光度值对显色剂用量作图，结果参见图4。

1.2.4.4 反应温度

准确移取1m L样品溶液于10m L具塞比色管中，加入1mLAlCl3溶液，分别在15、20、25、30、35、40℃下反应12min，70%乙醇定容待测，其他同上操作。以吸光度值对显色剂用量作图，结果参见图5。

1.2.4.5 体系pH

准确移取1mL样品液于10mL具塞比色管中，加入1mL 1%AlCl3溶液，分别加入pH为3.8、4.2、4.6、5.0、5.4、5.8、6.2、6.6的缓冲液2mL，室温放置12min，70%乙醇定容待测，其他同上操作，以吸光度值对pH作图，结果参见图6。

1.2.4.6 缓冲液用量

准确移取1m L样品溶液于10m L具塞比色管中，加入1mL 1%AlCl3溶液，分别加入pH为5.4的缓冲液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL室温放置12min，70%乙醇定容待测。其他同上操作，以吸光度值对缓冲液用量作图，结果参见图7。

1.2.5 测定方法评价

1.2.5.1 火棘提取液标准曲线的建立

分别量取浓度梯度为2、3、4、5、6、7、8、9、10mg/mL的火棘提取液1mL至10mL具塞比色管中，加入2mL pH5.4的醋酸-醋酸钠缓冲液，1 mL 2%AlCl3溶液，70%乙醇定容混匀，30℃反应12min后测定，同时作空白对照，依1.2.3操作，从而确定待检火棘提取液的线性浓度范围。

1.2.5.2 方法重复性考察

取2及10mg/mL火棘提取液各1mL，置于10mL具塞比色管中，依次加入2mL pH5.4的醋酸-醋酸钠缓冲液，1mL 2%AlCl3溶液，70%乙醇定容混匀，30℃反应12min，测定A285，共测定5次。此测定在相同条件下由同一分析人员独立完成。

1.2.5.3 方法稳定性考察

取2及10mg/mL火棘提取液各1mL，置于10mL具塞比色管中，加入2mL pH5.4的醋酸-醋酸钠缓冲液，1mL 2%AlCl3溶液，70%乙醇定容混匀，30℃反应，每隔20分钟测定一次A285，连续测定5次。测定结果之间的精密度称为稳定性。

1.2.5.4 方法重现性考察

取质量浓度为2及10mg/mL火棘提取液各1mL，置于10mL具塞比色管中，依次加入2mL pH5.4的醋酸-醋酸钠缓冲液，1mL 2%AlCl3溶液，70%乙醇定容混匀，30℃反应12min，测定A285，共测定5次。此测定在不同实验室，由不同分析人员完成，测定结果之间的精密度称为重现性。

1.2.5.5 加样回收率考察

取2mg/m L火棘提取液1m L，置于10m L具塞比色管中，加入2mLpH5.4的醋酸-醋酸钠缓冲液，1mL 2%AlCl3溶液，70%乙醇定容混匀，30℃反应12min，同时做空白对照，测定火棘提取液中总黄酮含量。再取2mg/mL火棘提取液1mL置于10mL具塞比色管中，加入0.015mg/mL芦丁对照品1mL，按上述相同方法测定溶液中总黄酮含量，重复测定5次，计算回收率。

回收率/%=（加入芦丁后火棘提取液总黄酮量-原火棘提取液中总酮量）/加入芦丁量×100%

2 结果与讨论

2.1 对照品的选择及最大吸收波长的确定

按照1.2.2设计，结果见图1。

图1 样品、芦丁及槲皮素标样紫外扫描图Fig.1 UV spectrogram ofsample，rutin and quercetin standard

分析可知，同样测试条件下，样品，芦丁和槲皮素在280 nm附近的吸收峰依次分别为285、274及275 nm；样品在360 nm～380 nm处无明显吸收峰，芦丁及槲皮素在360、374 nm处有吸收峰。显然，芦丁作为对照品，显色后紫外光谱图更接近样品；另外，火棘果中芦丁含量相对槲皮素而言更高，故选择芦丁作为对照品更具有代表性，相对更合适。因此，选择芦丁作为对照品，测定最大吸收波长285 nm。

2.2 标准曲线的绘制

按照1.2.3设计，可得芦丁样液浓度C（mg/mL）对吸光度值（A）的线性回归方程为A=11.22 0C+0.049 2（R2=0.998 3，n=7），结果表明芦丁浓度在0.009mg/m L～0.045mg/mL范围内线性关系良好。

2.3.1 显色剂用量

按照1.2.4.1设计，结果见图2。

图2 显色剂用量影响Fig.2 Effectof the dosagesofalum inum ch loride

分析可知，待测样品加入AlCl3液显色后溶液的吸光度值随着AlCl3用量的增加先快速增加，加入量为1mL时吸光度值达到最大，继续增大AlCl3用量，吸光度值逐渐下降至最后持平状态，此时，空白对照液颜色发生明显变化，故选择AlCl3用量1mL较合适。

2.3.2 显色剂浓度

按照1.2.4.2设计，结果见图3。

分析可知，固定AlCl3加入量为1mL，随其浓度增加，火棘提取液与之显色反应后溶液吸光度先快速增加，AlCl3浓度为2%时吸光度值达到最大，后随着AlCl3浓度继续增加而缓慢降低。因此在保证测试灵敏度高及空白对照液颜色不发生改变的前提下，选择2% AlCl3较合适。

图3 A lC l3浓度影响Fig.3 Effectof the concentration ofalum inum chloride

2.3.3 显色时间

外面黑得像午夜，法比离开了英格曼神甫。他回过头，见英格曼神甫走到受难圣像前，面对十字架慢慢跪下。法比此时还不知道在他和少佐说话时，一个念头在神甫脑子里闪现了一下。现在他要把那闪念追回来，仔细看看它，给它一番冷静的分析。

按照1.2.4.3设计，结果见图4。

图4 显色时间的影响Fig.4 Effectof reaction time

分析可知，火棘提取物与AlCl3显色反应后溶液的吸光度随着显色时间的增加先快速增加，后缓慢降低，在显色反应12min时吸光度值达到最大。因此在保证较高的测试灵敏度及空白对照液颜色不发生颜色改变的前提下，显色时间定为12min较合适。

2.3.4 反应温度

按照1.2.4.4设计，结果见图5。

图5 显色温度的影响Fig.5 Effectof reaction temperature

分析可知，火棘提取液与AlCl3显色反应后溶液的吸光度随着反应温度的增加先快速增加，后增幅渐缓，在30℃时吸光度值达到最大，继续提高反应温度，吸光度快速降低。因此选择显色温度30℃较合适。

2.3.5 体系pH

按照1.2.4.5设计，结果见图6。

图6 醋酸-醋酸钠缓冲体系pH的影响Fig.6 Effectof pH of HAc-NaAc buffer system

分析可知，火棘提取液与AlCl3显色反应后溶液的吸光度值随着体系pH的增加先快速增加，在pH= 5.4时吸光度值达到最大，此后，随pH增加，吸光度值缓慢下降，且空白对照液颜色发生改变，因此在保证较高的测试灵敏度及空白对照液颜色不发生改变的情况下，体系pH选定为5.4较合适。

2.3.6 缓冲液用量

按照1.2.4.6设计，结果见图7。

图7 缓冲液用量的影响Fig.7 Effectof dosageofHAc-NaAc buffer system

分析可知，火棘提取液与AlCl3显色反应后溶液的吸光度值随着缓冲液用量的增加先快速增加，在2mL时吸光度值达到最大，后缓慢降低。故选2mL缓冲液较合适。

2.4 测定方法评价

2.4.1 火棘提取液标准曲线关系的建立

按照1.2.5.1设计，以吸光度值A与火棘提取液浓度C（mg/m L）作回归方程为：A=0.050 0C-0.006 2（R2= 0.993 0，n=9）。分析可知火棘提取液浓度在2mg/mL～10mg/mL范围内线性关系良好，这为之后方法评价待测提取液浓度范围选择提供了依据。

2.4.2 方法重复性考察

按照1.2.5.2设计，记录相关数据，求出相对标准偏差RSD（%），实验结果见表1。

由表1可知，此测定方法的标准偏差分别为0.000 9和0.000 3，相对标准偏差分别为0.188 4%和0.293 8%，重复性很好。

2.4.3 方法稳定性考察

按照1.2.5.3设计，记录相关数据，求出相对标准偏差RSD（%），实验结果见表2。

表1 重复性实验Table1 Repeatability testof thedeterm ination results

表2 稳定性实验Table 2 Stability testsof the determ ination results

由表2可知，此测定方法的标准偏差分别为0.000 2和0.000 7，相对标准偏差分别为0.014 9%和0.684 9%，因此在溶液显色反应120min以内，此测定方法均呈现良好的稳定性。

2.4.4 方法重现性考察

按照1.2.5.4设计，记录相关数据，求出相对标准偏差RSD（%），实验结果见表3。

由表3可知，此测定方法的标准偏差分别为0.003和0.001，相对标准偏差分别为0.630 2%和0.961 5%，因此该方法重现性好。

表3 重现性实验Table 3 Reproducibility testsof the determ ination results

2.4.5 回收率考察

按照1.2.5.5设计，记录相关数据，求出相对标准偏差RSD（%），实验结果见表4。

表4 总黄酮回收率Table 4 Recovery testsof total flavonoids

由表4可知，该方法测定总黄酮的回收率为100.13%，相对标准偏差为0.016 6%。说明采用该方法用于测定火棘总黄酮具有较高的回收率，精密度良好。

3 讨论与结论

本实验采用AlCl3显色法测定了火棘提取液中总黄酮的含量，分别考察了对照品、显色剂浓度及用量、反应温度及时间、体系pH、缓冲液用量等因素对AlCl3显色反应的影响。结果表明，AlCl3显色法测定火棘提取物中总黄酮含量的最适条件为：1mL适宜浓度的火棘提取液，加入1mL质量浓度2%AlCl3，2mL pH5.4的醋酸-醋酸钠缓冲液，70%乙醇定容至10 m L并混匀，不避光条件下30℃显色反应12min后，以芦丁为对照品，于波长285 nm处测定吸光度。该测定方法具有良好的重复性、稳定性、重现性，回收率较高。

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Systematic Investigation on AlCl3Colorimetric Determ ination of Total Flavonoids from Pyracantha Fortuneana Fruit

YANYou-yu1，2，XIA Ting2，ZHANGYu2，YOUYuan2，ZHAOChun-fang1，YULong-jiang1，*
（1.Schoolof Life Science&Technology，HuazhongUniversityof Science&Technology，Wuhan 430074，Hubei，China；2.Schoolof Biological&PharmaceuticalEngineering，Wuhan Polytechnic University，Wuhan 430023，Hubei，China）

Rutin was taken as reference substance and the optimal condition of aluminum chloride colorimetric assay affecting the determination of total flavonoids from Pyracantha fortuneana extractwasestablished.Several parameters，such as the standard substance，light，reaction time and temperature，concentration and the amount of chromogenic agent，pH and buffer dosage that affecting the color reaction of total flavonoids were investigated systematically.The results indicated the appropriate reaction conditionswere as the following：2mL 2%（m/m）Aluminum chloride was added to 1 m L pyracantha extractwith specific concentration，after being blended the reactionwascarried outat30℃for12min，then absorbancewasmeasured at285 nm.Asa result，Statisticalanalysisshowed themethod had good repeatability，stability，reproducibilityand high recovery rate.

Pyracantha Fortuneana；total flavonoids；rutin；aluminum chloride colorimetricmethod

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.05.023

2014-09-20

鄢又玉（1975—），女（汉），讲师，博士，研究方向：天然药物。

*通信作者