L-亮氨酸发酵培养基及基本发酵条件的优化

常珠侠

（安徽丰原发酵技术工程研究有限公司，安徽蚌埠 233010）

L-亮氨酸发酵培养基及基本发酵条件的优化

常珠侠

（安徽丰原发酵技术工程研究有限公司，安徽蚌埠 233010）

以黄色短杆菌FY-18为出发菌株，利用摇瓶发酵生产L-亮氨酸，并利用正交试验和单因素试验分别对其发酵培养基和基本发酵条件进行研究，从而优选出最佳培养基组分和培养条件参数。结果表明，L-亮氨酸发酵培养基的最适配比为：葡萄糖160 g/L、豆粕水解液20 g/L、玉米浆20 g/L、毛发粉15 g/L、硫酸铵70 g/ L；其发酵最佳培养条件为：初始pH 7.2，培养温度32℃，发酵接种量为10%。在上述最佳条件下摇瓶中发酵的产酸量为22.5 g/L。

L-亮氨酸；菌种；发酵；正交试验

氨基酸是构成蛋白质的基本单位，是生物体内不可缺少的营养成分，在生物体内具有特殊的生理功能，参与细胞中多种化合物的合成代谢。L-亮氨酸是常见的18种氨基酸之一，也是人体8种必需氨基酸之一，于1819年由Proust首先从奶酪中分离得到，后来Braconnot从肌肉与羊毛的酸水解物中得到其结晶。

L-亮氨酸在医药、食品、饲料、化妆品等行业具有重要用途。由于L-亮氨酸和L-异亮氨酸、L-缬氨酸的分子结构中都含有一个甲基侧链，故被称为支链氨基酸［1～2］。在医药行业，L-亮氨酸主要用于复合结晶氨基酸静脉注射液，可维持危重病人的营养需求。L-亮氨酸还可用于合成具有抗癌、抗病毒、抑制细菌生长等生物活性的L-亮氨酸Schiff碱Cu2+、Ni2+、Zn2+配合物。另外，选用L-亮氨酸作为氨基酸部分的N-稀有脂肪酰基-L-亮氨酸具有较高抗菌活性［1］。还有学者发现，亮氨酸的添加可抑制败血症引起的骨骼肌蛋白质合成减少，从而缓解其带来的体重下降等负面效应。L-亮氨酸可用于诊断和治疗小儿突发性高血糖症和作为头晕治疗及营养滋补类药物。L-亮氨酸与稀土的配合物是氨基酸肥料和农药的一种，不仅能增产，防止农作物病虫害，并且能被日光和微生物降解，是目前深受人们喜爱的“绿色农药”。由L-亮氨酸合成的多聚物是临时创伤敷料的最佳原料之一，也极具发展潜质［3］。

由于L-亮氨酸在多个行业均有重要应用，而目前总体状况是供不应求，故有关其生产的研究，特别是微生物发酵法生产L-亮氨酸是未来一段时间内极为重要的研究领域。我们利用黄色短杆菌FY-18对发酵生产L-亮氨酸的工艺条件进行了初步优化研究，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌种黄色短杆菌FY-18为安徽丰原发酵技术工程研究有限公司菌种室保藏。

1.1.2 仪器设备培英DZ-900振荡器（太仓市实验设备厂）；7230G可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）；高效液相色谱仪（Agilent 1200，安捷伦科技有限公司）；生物传感分析仪SBA-40C（山东省科学院生物研究所）等。

1.1.3 培养基种子液体摇瓶培养基（100 mL）：葡萄糖2.00 g，磷酸氢二钾0.50 g，硫酸镁1.00 g，硫酸亚铁0.02 g，硫酸铵0.50 g，豆粕水解液150 mg，蛋氨酸40 mg，玉米浆0.50 g，谷氨酸4.00 g，琼脂粉1.50 g。发酵液体摇瓶培养基（100 mL）：葡萄糖10.00 g，磷酸氢二钾0.50 g，硫酸镁0.50 g，硫酸亚铁0.02 g，硫酸铵7.00 g，豆粕水解液2.00 g，蛋氨酸60 mg，玉米浆2.00 g，毛发粉1.50 g， L-异亮氨酸5 mg。

1.2 试验方法

1.2.1 种子固体平板培养方法将上述种子液体摇瓶培养基添加1.5%琼脂粉后制得平板培养基，再用NaOH调pH至7.0，121℃30 min灭菌后，冷却至50℃以下，待平板培养基凝固后涂布接种，并在恒温培养箱中32℃培养24 h，待用。

1.2.2 种子液体摇瓶培养方法将上述种子培养基配制完成后，用NaOH调pH至7.2，121℃灭菌20 min，每只摇瓶中添加4 gCaCO3（预先150℃干热灭菌准备好），从固体平板上选取一接种环的菌体接入摇瓶中，装液量为100 mL/500 mL，培养条件31.5℃，摇床转速200 r/min。种子合格标准为：培养时间约24 h，菌体OD值（620 nm）1.2。

1.2.3 发酵液体摇瓶培养方法将上述发酵培养基配制完成后，用NaOH调pH至7.2，121℃灭菌20 min，每只摇瓶中添加4 g CaCO3（预先150℃干热灭菌准备好），从培养合格的种子液中吸取1 mL菌液接入摇瓶中，装液量为100 mL/500 mL，培养条件31.5℃，摇床转速300 r/min。

1.2.4 分析和测定方法［4］①L-亮氨酸液相测定。将发酵液做一定处理后，用高效液相色谱法定量测定发酵液中游离的L-亮氨酸含量。②发酵液菌体浓度测定。发酵液中菌体浓度采用菌体溶液吸光度A620nm表示。取发酵液0.5 mL，加入9.5 mL 0.1 mol/L稀盐酸中和碳酸钙，混匀，分光光度计620 nm波长下用蒸馏水做空白进行比色，比色结果记为A620nm。③发酵液残糖的测定。采用生物传感分析仪进行残糖的测定。

2 结果与分析

2.1 利用正交试验对发酵培养基关键组分含量的优化

对于发酵产酸而言，种子培养基的作用主要在于培养得到较多的菌体，而发酵培养基的组成及含量对于产物的合成速度及产量有着更至关重要的影响。因此有必要对发酵培养基进行研究，通过小试试验得到的数据，并对试验结果进行整理和分析，从而优选出最佳的发酵培养基配方。

L-亮氨酸发酵培养基配方的关键组分有葡萄糖（A）、豆粕水解液（B）、玉米浆（C）、毛发粉（D）、硫酸铵（E）等［5］。其中，葡萄糖是碳源，也是能源，所以需要优先考虑葡萄糖对发酵的影响；豆粕水解液、玉米浆、毛发粉等是有机氮源，其中含有微生物生长所必需的部分微量元素、氨基酸、维生素等，也是发酵培养基的重要组成成分；而硫酸铵是无机氮源，这些都是发酵培养基的关键因素。通过L16（45）正交试验对菌株的发酵培养基的关键营养成分进行优化，其结果见表1和表2。

如表2所示，主要亮氨酸产量指标。对其分析计算，如Kx＝N1+N2+N3+N4（x为1、2、3、4，N即为A、B、C、D、E），kx=Kx/4。得到最优方案为A4B3C3D3E4，即葡萄糖160 g/L、豆粕水解液20 g/L、玉米浆20 g/L、毛发粉15 g/L、硫酸铵70 g/L。以此最优方案为发酵培养基配方的主要成分的含量为条件，得出试验结果为22.5 g/L，即最佳产酸结果。

创新决定高度，实干铸就辉煌。没有创新实干的精神，就没有辽宁曾经的胜利；没有创新实干的精神，更不可能有辽宁明天的辉煌。习近平总书记指出， “惟创新者进，惟创新者强，惟创新者胜。”在这种创新精神的指引下，在实干态度的生发下，辽宁人民在今后的发展过程中会继续披荆斩棘，以创新的理论、创新的制度、创新的文化、创新的科技，去再创辽宁老工业基地的发展新高。

表1 L16（45）正交试验因子水平

表2 L16（45）正交试验数据及结果分析

2.2 利用单因素试验对发酵培养基本条件的优化

生物发酵过程实际上是由众多生物化学反应所构成的综合反应过程，除了目的产物之外，还会生成许多副产物。而影响发酵过程的几大关键因素，例如培养温度、培养基初始pH和种龄等控制参数的变化对发酵产物的生成速率、产量以及副产物的形成都有着显著的影响。因此，需要通过摇瓶的单因素对照试验来确定上述最佳的基本条件参数［6］。

2.2.1 培养温度的优化温度是影响微生物生长代谢的基本环境因素之一。微生物发酵产物的的生成、菌体的生长与繁殖都与相关生物化学反应中酶的活性有着直接的关系，而酶活对温度的变化很敏感，合适的温度将有利于酶促反应，促进目的产物的产量。试验利用摇瓶培养方式进行L-亮氨酸的发酵，考察26～36℃时菌株的生长和产酸情况，从而优选出最佳的培养温度。

试验利用摇瓶进行培养发酵，除温度以外，其他的培养条件均相同，培养30 h后，分别对不同摇瓶的L-亮氨酸含量进行测定并进行对照分析。由图1可知，32℃为L-亮氨酸最佳的培养温度，30 h L-亮氨酸含量达到23.6 g/L。而26℃和36℃时，L-亮氨酸含量分别为18.3 g/L和15.8 g/L。可见，由于温度对菌体生长及发酵相关酶系的影响，过高或过低的温度都极大地影响L-亮氨酸的发酵水平。

图1 不同培养温度对L-亮氨酸含量的影响

2.2.2 发酵接种量的优化接种量是指移入种子液的体积和接种后培养液体积的比例。接种量的大小决定生产菌种在发酵罐中生长繁殖的速度，采用较大的接种量可以缩短发酵罐中菌株繁殖达到高峰的时间，使产物的形成提前到来，并可减少杂菌的生长机会。但接种量过大或者过小，均会影响发酵。过大会引起溶氧不足，影响产物合成，而且会过多移入代谢废物，也不经济；过小会延长培养时间，降低发酵罐的生产率。

试验利用摇瓶进行培养发酵，发酵摇瓶的接种方式为利用无菌操作吸取同一瓶成熟的种子培养液，然后按照不同的接种量添加入发酵摇瓶进行培养，其他的培养条件均相同，在培养30 h后，分别对不同摇瓶的L-亮氨酸含量进行测定并进行对照分析。如图2所示，10%为最佳的接种量，用10%的接种量培养30 h时，L-亮氨酸的含量达到22.5 g/L；用12%的接种量时，L-亮氨酸的含量也达到22.3 g/L。而接种量为6%时，L-亮氨酸的产量最低，其次是接种量16%。分析原因为接种量过小，造成前期菌量少，生长停滞期较长，从而延长了整个发酵周期；接种量过大时，耗氧旺盛，而摇瓶中往往通气条件受限，造成溶氧过低影响发酵。

图2 不同接种量对L-亮氨酸含量的影响

2.2.3 初始pH的优化微生物培养环境的pH对其生长繁殖、营养代谢都有着极大的影响，而不同种类的微生物以及不同产物的生产菌所需要的最适pH都有着很大差别，因此，有必要对L-亮氨酸生产菌的最适产酸pH进行初步研究。

试验利用摇瓶进行培养发酵，利用酸碱试剂对发酵摇瓶的初始pH进行调节，其他的培养条件均相同，在培养30 h后，分别对不同摇瓶的L-亮氨酸含量进行测定并进行对照分析。发酵所用菌种黄色短杆菌为肠道杆菌，一般最适生长pH为7.0左右。如图3所示，在摇瓶发酵中最高产酸的初始pH为7.2，其次为pH7.6，L-亮氨酸含量分别为22.5 g/L和23.2 g/L，过高或过低的pH对其含量有着极大影响。考虑到摇瓶发酵不能调控pH，过程pH或因为发酵产生有机酸而不断下降，造成中后期发酵受到抑制。因此，在利用发酵罐进行L-亮氨酸发酵，且能够用碱液维持过程pH时，控制pH为7.2可作为L-亮氨酸发酵生产最佳培养条件。

图3 不同初始pH对L-亮氨酸含量的影响

3 小结与讨论

1）利用摇瓶正交试验对发酵培养基中关键组分含量进行优化，最终确定葡萄糖160 g/L、豆粕水解液20 g/L、玉米浆20 g/L、毛发粉15 g/L、硫酸铵70 g/L为发酵培养基组分最优化配方。通过摇瓶单因素对照试验，最终确定产酸的最佳发酵基本培养条件为发酵接种量10%，培养温度32℃，初始pH为7.2。

2）要实现L-亮氨酸发酵的工业化生产，还有许多研究工作要做。首先，菌种还需要继续进行改良，使其能耐更高的葡萄糖浓度、缩短发酵时间、提高L-亮氨酸产量、减少杂质和杂酸的产生等。除了基本的诱变技术如紫外线诱变、化学制剂诱变等外，体内、体外的基因重组等基因工程技术也可应用于构建性状优良的高产菌株，例如细胞融合、转导、转化等。其次，工业发酵的工艺参数也要进一步优化，特别是逐级放大发酵的过程中，大多数工艺参数都将有所变化，要获得稳定的L-亮氨酸产量就要不断摸索各种条件。L-亮氨酸的提取也是生产L-亮氨酸很重要的一步工艺，也可以从提取过程工艺条件的优化方面考虑生产的改良。

［1］中国医药集团上海化学试剂公司.试剂手册［M］.上海：上海科学技术出版社，2002.

［2］伍时华，方杰，陈宁.L-亮氨酸高产菌的代谢控制育种［J］.生物科技通讯，2001，12（3）：27-30.

［3］张克旭.代谢控制发酵［M］.北京：中国轻工业出版社，2007.

［4］沈同，王镜岩.生物化学［M］.北京：高等教育出版社，1990.

［5］FREUNDLICH M，BURNS RO，UMBARGER HE.Control of isoleucine，valine，and leucine biosynthesis.I. Multivalent repression［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1962，48：1 804-1 808.

［6］UMBARGER HE，BROWN B.Threonine deamination in Escherichia coli.Ⅱ.Evidence for two L-threonine deaminases［J］.J.Bacteriol，1957，73：105-112.

（本文责编：郑丹丹）

Optimization of Medium Components and Cultural Conditions of L-leucine

CHANG Zhu-xia
（Anhui BBCA Fermentation Technology Engineering Research Co.，Ltd.，Bengbu Anhui 233010，China）

Brevibacterium flavum FY-18 was used as original strain to produce L-leucine by shaking flask fermentation.The orthogonal experiments and single factor experiments were adopted to optimize the fermentation culture medium and conditions of L-leucine.The results indicated that the optimized compositions of medium were 160 g/L glucose，20 g/L soybean meal hydrolysate，20 g/L corn steep liquor，15 g/L hair powder and 70 g/L ammonium sulfate，and the fermentation conditions were initial pH at 7.2，32℃and inoculum 10%.Under the optimized fermentation conditions the production of L-leucine was up to 22.5 g/L.

L-leucine；Strain；Fermentation；Orthogonal Experiment

TQ922

A

1001-1463（2015）04-0007-04

10.3969/j.issn.1001-1463.2015.04.003

2015-02-11

常珠侠（1962—），女，安徽蚌埠人，高级工程师，主要从事生物工程技术研究。联系电话：（0）18055263388。E-mail：changzhuxia6209@163.com