RP-HPLC法测定蓝莓和黑莓中VC的含量

刘志刚，候浪，王瑞，岑顺友，刘晓燕，谢晓林

（1.贵阳学院食品与制药工程学院，贵州贵阳550005；2.贵州省果品加工工程技术研究中心，贵州贵阳550005）

RP-HPLC法测定蓝莓和黑莓中VC的含量

刘志刚1，2，候浪1，王瑞1，2，岑顺友2，刘晓燕1，2，谢晓林1

（1.贵阳学院食品与制药工程学院，贵州贵阳550005；2.贵州省果品加工工程技术研究中心，贵州贵阳550005）

建立了蓝莓和黑莓中VC含量的高效液相色谱测定方法。样品用0.5%草酸溶液低温振荡提取后，进行高效液相色谱分析，色谱柱为Agilent C18（4.6 mm×250 mm，5 m），流动相为甲醇-0.1%磷酸溶液（5∶95），流速0.8 m L/min，检测波长242 nm。研究结果表明，VC在0.02mg/mL～0.4mg/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系，r为0.999 6，平均加样回收率为97.1%，RSD均小于3.0%。所建立方法快速简便、准确度高，能够用于测定蓝莓和黑莓中VC的含量。

蓝莓；黑莓；VC；HPLC；含量测定

蓝莓为杜鹃花科越橘属（Vaccinium.spp）多年生灌木，蓝莓果实呈深蓝色，被白霜，含有丰富的维生素、花色苷和多酚等生物活性成分[1-3]，有“水果皇后”的美誉。黑莓为蔷薇科悬钩子属灌木，果实为黑色或者暗紫色聚合果，富含VC和铁等微量元素，具有的抗氧化等多种生理活性[4-5]。目前测定水果中VC含量的方法很多，国标法采用2，6-二氯靛酚法测定，此外，还包括荧光光度法和分光光度法等[6-7]，但蓝莓和黑莓果实均富含花色苷等天然色素，采用上述方法测定时干扰因素较多，有学者采用高效液相色谱法测定猕猴桃、刺梨等水果中VC的含量[8-9]，有文献报道了蓝莓中草酸、酒石酸、苹果酸及鞣花酸等成分的HPLC含量测定方法[10-11]，而有关蓝莓和黑莓中VC的HPLC测定方法鲜见文献报道，本研究首次建立了RP-HPLC法快速测定蓝莓和黑莓中VC的定量测定方法，并对7个不同品种蓝莓和黑莓中的VC含量进行了测定，从而为蓝莓和黑莓相关产品的开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

甲醇（色谱纯）：美国TEDIA公司；冰醋酸、磷酸均为分析纯：重庆川江化工有限公司；水：为重蒸水，自制；VC对照品（批号：HG/T1534F1994，纯度：99.0 %）：上海试四赫维化工有限公司；蓝雨、北陆、园蓝、芭尔德温、梯芙蓝、粉蓝、灿烂等品种蓝莓和黑莓鲜果均于2013年8月10日采自贵州省麻江县宣威镇龙崩蓝莓基地。

1.2 仪器与设备

SHIMADZU高效液相色谱仪（LC-20AT输液泵，SPD-M20A紫外检测器，LC solution色谱工作站）；AS3120A型超声波提取器：天津奥特赛恩斯仪器有限公司；SHA-B恒温振荡器：常州澳华仪器有限公司；SHZ-Ⅲ型循环水真空泵：上海亚荣生化仪器厂；BCFCO型电热恒温水浴锅：北京长风仪器仪表公司；JJ-2型组织捣碎机：金坛市易晨仪器制造有限公司；AUW 120D型分析天平：日本岛津公司。

1.3 样品制备方法

1.3.1 对照品溶液制备

称取VC对照品10mg，精密称定，置50mL棕色容量瓶中，用0.1%磷酸溶液稀释成浓度为0.2mg/mL的对照品溶液。

1.3.2 样品溶液制备

称取蓝莓果浆约5.0 g，精密称定，加入0.5%草酸溶液5mL溶解，5℃低温下于振荡器中提取20min，抽滤，滤液用0.45μm微孔滤膜滤过，作为供试品溶液进行HPLC定量分析，黑莓供试品溶液的制备方法同上。1.4 HPLC色谱条件

色谱柱采用AgilentHC-C18（4.6mm×250mm，5μm）；流动相为甲醇-0.1%磷酸溶液（5∶95）；流速0.8mL/min；检测波长242 nm；进样量20μL；柱温为室温。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的绘制

准确称取一定量的VC对照品，精密称定，分别置50m L棕色量瓶中，以0.1%磷酸溶液溶解并稀释定容，分别配制成浓度为0.02、0.1、0.2、0.3、0.4mg/mL的VC工作溶液，用0.45μm微孔滤膜过滤，按1.4项下色谱条件分析，由色谱峰面积和溶液浓度绘制标准曲线，结果VC在0.02mg/mL～0.4mg/mL范围内线性关系良好，Y=4.32×107X-1.51×103，r=0.999 6。

2.2 精密度试验

取同一蓝莓果浆样品，按照1.3.2项下方法制备样品溶液，重复进样6次，记录色谱峰面积，计算VC峰面积的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD），其平均RSD为0.6%，说明方法的精密度良好。

2.3 稳定性试验

取供试品溶液，4℃低温下放置24 h，分别在0、2、4、8、12、24 h测定，记录色谱峰面积，计算得色谱峰峰面积的RSD值均小于2.0%，表明供试品溶液在4℃低温下可保持24 h稳定；另取供试品溶液，室温下放置8 h，结果色谱峰峰面积的RSD值已大于8.0%，表明样品中VC在室温下放置8 h不稳定。

2.4 重复性试验

取同一批蓝莓果浆样品5份，按照1.3.2项下方法制备供试品溶液，进样分析，记录峰面积，VC峰面积的RSD为1.2%，说明方法的重复性良好。

2.5 回收率试验

精密称取同一批已知含量的蓝莓样品，精密加入浓度为10μg/mL的VC标准溶液适量，按1.3.2项下制备方法供试液共5份，进样分析，由测得量与加入量计算回收率，结果VC的平均加样回收率为97.1%，相对标准偏差（RSD）不大于3.0%，表明方法准确度良好。2.6 样品测定

分别取所采集到7个不同品种蓝莓和1个黑莓样品，照1.3.2项下供试品溶液制备方法制备样品溶液，进样20μL，采用外标法计算含量，结果蓝莓中VC的含量分布在1.57mg/100 g～4.01mg/100 g范围内，黑莓中VC的含量较低（见图2）。

图2 不同品种蓝莓和黑莓鲜果中VC的含量Fig.2 The vitamin C content of different varieties of blueberry and blackberry in fresh fruit

3 结论

本方法以0.5%草酸溶液作为提取溶液，低温振荡提取蓝莓和黑莓样品中的VC，操作简单快速，可避免样品中VC被氧化和基质成分的干扰。采用高效液相色谱法进行测定时，在流动相中加入0.1%磷酸溶液作为酸抑制剂，色谱峰对称性良好，既能达到基线分离的要求，又有适宜的保留时间，结果稳定准确，且灵敏度高，适合用于鲜果样品中VC的测定。

采用所建立分析方法分别对产自我国南方蓝莓主产地贵州省麻江县7个不同品种蓝莓和1个品种黑莓中的VC含量进行测定，由结果可知，不同品种蓝莓中VC的含量相差十分悬殊，在所检测7个品种中，粉蓝中VC含量最高，蓝雨VC含量最低，而各品种蓝莓中VC的含量均远高于黑莓，上述研究结果为蓝莓和黑莓相关产品的开发利用提供参考。

[1] Prior R L,WU X L,GU LW,et al.Whole berries versus berry anthocyanins:interactions with dietary fat levels in the C57BL/6J mouse model of obesity[J].Journal of agricultural and food chemistry, 2008,56(3):647-653

[2]YIW G,AKOH C C,FISCHER J,et al.Absorption of anthocyanins from blueberry extracts by caco-2 human intestinal cell monolayers [J].Journal of agricultural and food chemistry,2006,54(15):5651-5658

[3] 胡雅馨,李京,惠伯棣.蓝莓果实中主要营养及花青素成分的研究[J].食品科学,2006,27(10):600-603

[4]Seeram NP,Momin RA,Nair MG,et al.Cyclooxygenase inhibitory and antioxidant cyaniding glycosides in cherries and berries[J]. Phytomedicine,2001,8(5):362-369

[5] Elisia I,Hu C,Popovich D G,et al.Antioxidant assessment of an anthocyanin-enriched blackberry extract[J].Food Chemistry,2007 (101):1052-1058

[6]傅维,杨彩霞.荧光分光光度法测定几种天津市售水果中维生素C的含量[J]．安徽农业科学,2011,39(23):14392-14393,14411

[7]刘薇,王君,刘德明,等．分光光度法测定蓝莓果中维生素C的含量[J]．湖南农业科学,2013(2):35-36

[8]李玉明,张少华.猕猴桃中维生素C的HPLC分析[J]．计算机与应用化学,2011,28(4):458-460

[9]肖竦.RP-HPLC法测定刺梨中的VC含量[J]．安徽农业科学,2011, 39(3):1356,1358

[10]胡小露,刘卉,鲁宁,等.HPLC法同时测定蓝莓汁及其发酵酒中9种有机酸[J]．食品科学,2012,33(16):229-232

[11]刘艳,宋立秋,范俊娟,等．HPLC法测定蓝莓中鞣花酸含量[J]．江苏农业科学,2008,11(3):217-219

Determination of Vitamin C in Blueberry and Blackberry by RP-HPLC

LIU Zhi-gang1，2，HOU Lang1，WANG Rui1，2，CEN Shun-you2，LIU Xiao-yan1，2，XIE Xiao-ling1
（1.Department of Food and Pharmaceutical Engineering，Guiyang University，Guiyang 550005，Guizhou，China；2.Guizhou Engineering Research Center for Fruit Processing，Guiyang 550005，Guizhou，China）

To develop a method for the determination of Vitamin C in blueberry and blackberry．An HPLC method has been developed to determine Vitamin C on Agilent C18（4.6 mm×250mm，5 m）column with the mobile phase of consisting of5%（v/v）methanol and 0.1%phosphoric acid．The flow rate was 0.8m L/min and the UV detection wavelength was set at 242 nm．The result showed that linearity of Vitamin C was good in the ranges of 0.02mg/mL-0.4mg/mL（r=0.999 6）．The average recovery of Vitamin C was97.1%with RSD less than 3.0%．The method is sample and accurate and could be used to control the quality of blueberry and blackberry．

blueberry；blackberry；VC；HPLC；assay

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.01.025

2014-01-29

贵州省教育厅产学研基地项目（黔教合KY字[2012]033号）；贵阳市科技局现代药业计划（筑科合同[2012204]31号）

刘志刚（1976—），男（汉），副教授，博士，主要从事食品质量安全与药物分析研究工作。