玉米内州萎蔫病菌LAMP快速检测方法的建立

玉米内州萎蔫病菌LAMP快速检测方法的建立

单长林1，李雪松1，李孝军1，周 圆1，杨赛军1，王 健1,张建成2

(1.舟山出入境检验检疫局,浙江舟山 316000；2.嘉兴出入境检验检疫局,浙江嘉兴 314000)

摘要[目的] 建立玉米内州萎蔫病菌的快速恒温扩增检测技术。 [方法]利用GenBank公布的玉米内州萎蔫病菌(Clavibacter michiganensis subsp. nebraskensis，Cmn) 16S-23S序列设计LAMP (loop-mediated isothermal amplification)引物，建立玉米内州萎蔫病菌LAMP检测体系，并对反应条件进行了优化。[结果]LAMP 在内引物、环化引物和外引物比为6∶4∶1(30 pmol∶20 pmol∶5 pmol)的25 μl体系下64 ℃反应30 min为最佳反应条件，且LAMP引物能从供试的7种菌株中特异性扩增出Cmn 梯度性条带。以玉米内州萎蔫病菌基因组和菌悬液梯度稀释液为模板检测LAMP体系的灵敏度，结果显示，LAMP检测体系针对基因组和菌悬液的灵敏度分别达到了50 fg和3.6 CFU，比普通PCR灵敏度高100倍。[结果]LAMP检测体系简单、快速、灵敏度高、特异性好，在玉米内州萎蔫病菌检测方面潜力巨大。

关键词玉米内州萎蔫病菌；LAMP；检测

中图分类号S188

基金项目浙江检验检疫局科研项目(ZK201227);浙江省科技厅重大科技专项重点农业项目(2009C12054)；浙江省科技厅公益技术研究农业项目(2013C32002)。

作者简介单长林(1987-)，男，山东单县人，农艺师，硕士，从事进出境动植物检验检疫工作。

收稿日期2015-06-05

The Establishment of a Rapid Detection Method ofClavibactermichiganensissubsp.nebraskensisLAMP

SHAN Chang-lin,LI Xue-song，LI Xiao-jun et al (Zhoushan Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Zhoushan, Zhejiang 316000)

Abstract[Objective]The aim was to establish a rapid detection method of Clavibacter michiganensis subsp. nebraskensis LAMP. [Method] The LAMP primers was designed by the rRNA 16S-23S of the genome of Clavibacter michiganensis subsp. nebraskensis, were verified using Clavibacter michiganensis subsp. nebraskensis and other non-target strains. [Result]The data showed that the optimal amplification condition was at 64 ℃ for 30 min with 30 pmol of F3(B3), 20 pmol of LF(LB) and 5 pmol of FIP(BIP). Both the sensitivity and the specificity of the LAMP assay developed in the study were excellent. The detection limit of the LAMP was as low as 50 fg ( for DNA) and 3.6 CFU (for bacteria) per reaction. Compared with conventional PCR method, the LAMP assay developed in this study was more specific and more sensitive. Therefore, the LAMP method could be considered as an effective tool for the rapid screening of Clavibacter michiganensis subsp. nebraskensis. [Conclusion] The study showed that the loop-mediated isothermal amplification(LAMP) could be used as a reliable, rapid and simple method for detection of Clavibacter michiganensis subsp. nebraskensis (Cmn) causing Goss’s Bacterial Wilt and Leaf Blight of Corn.

Key wordsClavibactermichiganensissubsp.nebraskensis; LAMP; Detection

玉米内州萎蔫病(Goss’s Bacterial Wilt and Leaf Blight of Corn)是由执安棒形杆菌内布拉斯加亚种(Clavibactermichiganensissubsp.nebraskensis,Cmn)引起的一种严重的细菌性病害，可导致玉米产量损失率高达50%[1]。自1969年首次发现于内布拉斯加州中部[2],该病通过种子传带进行远距离传播[3]，目前已扩散至美国多州和加拿大部分地区[4-6]，在我国尚未发现。玉米在我国的播种面积和产量均居世界第二位[7]，而且我国大部分玉米种植区适合Cmn的发生与传播[8]，该病菌一旦传入，将严重威胁我国粮食生产安全，因此预防和控制玉米内州萎蔫病，对确保玉米生产可持续发展具有极为重要的意义。

Cmn为革兰氏阳性，不产孢，不固酸，严格好氧性，隶属于厚壁菌门(Firmicutes)厚壁菌纲(Firmibacteria)棒型杆菌属(Clavibacter)。目前针对其检测方法主要有分离培养法[9-10]、血清学检测[11-13]和分子生物学检测[14-18]等方法，分离培养法和血清学检测方法操作复杂、耗时较长且灵敏度较低不适合快速检测。分子生物学检测方法具备快速、准确和灵敏的特点，但其检测过程需PCR仪等设备支持，无法实现现场操作。2000年，日本学者Notomi等[19]研发出一种核酸等温扩增方法——环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)，其针对靶标序列的6个区域设计4条引物，在恒温(60～ 65 ℃)条件下，利用Bst DNA 聚合酶的链置换作用，按照目标序列将dNTPs连接完成DNA扩增，同时释放出焦磷酸根离子。焦磷酸根离子与Mg2+结合生成肉眼可视的白色焦磷酸镁沉淀，使LAMP结果不必借助其他方式即可快速读取。因此，恒定的扩增条件，可视的结果显示使LAMP技术非常适合现场的快速检测。

玉米内州萎蔫病菌rRNA 16S-23S基因间隔序列已被证实具备菌种间差异性，常用于分子生物学鉴定[20-21]。笔者利用LAMP技术，针对rRNA 16S-23S基因间隔序列设计一套引物，建立玉米内州萎蔫病菌的快速恒温扩增检测技术。

1 材料与方法

1.1 菌株供试菌株玉米内州萎蔫病菌(Clavibactermichiganensissubsp.nebraskensis，Cmn)、玉米细菌性枯萎病菌(Pantoeastewartiisubsp.Stewartii，Pss)由浙江省检验检疫科学技术研究院张明哲博士提供；燕麦食酸菌(Acidovoraxavenaesubsp.Avenae，Aaa)、西瓜细菌性果斑病菌(Acidovoraxavenaesubsp.citrull，Aac)、黄单胞菌(Xanthomonasoryzae，oryzae，Xoo)由浙江大学李斌博士提供；菜豆萎蔫病菌(Curtobacteriumflaccumfacienspv.flaccumfaciens，Cff)、丁香假单胞杆菌菜豆致病变种(Pseudomonassyringaepv.phaseolicola，Psp)由舟山出入境检验检疫局国家粮油重点实验室保存。

1.2 试剂和仪器 LAMP法脱氧核糖核酸扩增试剂盒(荣研)，细菌基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN)，DL 2000 DNA Ladder Marker (TaKaRa)，琼脂糖Agarose H(上海生工)，LB琼脂(杭州微生物试剂有限公司)；金属浴Thermomixer comfort(eppendorf),凝胶成像仪(BIO-RAD),紫外分光光度计NANODROP 2000(Thermo)。

1.3 引物设计与合成玉米内州萎蔫病菌16S-23S基因间隔序列已被证实在细菌种间有相当大的可变性,常用来比较细菌的亲缘性远近[22]。根据 GenBank 公布的玉米内州萎蔫病菌Cmn 16S-23s序列(Accession number: JN613835.1)，利用LAMP在线引物设计软件(V3版)，设计玉米细菌性枯萎病菌LAMP引物。引物序列：F3：CGCTCATGGGTGGAACAT，B3：GTTCTCAATATACGGGCGGT；FIP：CATGCCCTCGACACACCAGACTGATGTGTCGGGCTGCTA，BIP：CGCTGTTGGGT-CCTGAGGGAACGAAAGGACGACGGAAAG；LF：ACCCCACA-AGGAGGCGTA，LB：GCACCTTCGGGTGTGTCTG。引物位置见图1。

1.4菌体培养和DNA模板制备菌体的活化培养用普通LB固体培养基，涂板后放入25 ℃恒温培养箱中培养24 h，后挑取单菌落接入普通LB培养液，25 ℃培养12 h(OD600≈0.8)。离心收集菌体，利用TIANGEN细菌基因组DNA提取试剂盒提取细菌基因组，紫外分光光度计Nanodrop 2000检测提取质量和浓度，-20 ℃备用。

1.5 LAMP 扩增体系优化以脱氧核糖核酸扩增试剂盒(LAMP法)说明书推荐体系为参照。设置反应温度梯度为61、62、63、64、65 ℃；设置内引物、环化引物和外引物比例分别为2∶2∶1(10 pmol∶10 pmol∶5 pmol)，4∶4∶1(20 pmol∶20 pmol∶5 pmol)，6∶4∶1(30 pmol∶20 pmol∶5 pmol)，8∶4∶1(40 pmol∶20 pmol∶5 pmol)；设置反应时间梯度为15、30、45、60 min。扩增产物加SYBR Green I染料以阴性对照进行目测或于2.0%琼脂糖凝胶电泳分析。

1.6特异性验证取玉米内州萎蔫病菌和各参比菌株基因组，分别取2 μl为模板进行LAMP扩增反应和常规PCR扩增反应[18]，验证LAMP扩增反应特异性。

1.7 灵敏性检测 取玉米内州萎蔫病菌基因组，用灭菌的双蒸水10倍梯度稀释(10-1～10-7)，取2 μl 为模板分别进行LAMP扩增反应并与普通PCR反应体系[18]比较，验证LAMP扩增法检测体系对细菌基因组的灵敏性；制备玉米内州萎蔫病菌悬液，进行10倍梯度稀释(10-1～10-6)，涂板计数法测定其浓度，分别取2 ul稀释菌液进行LAMP扩增反应和PCR扩增反应，检测LAMP等温扩增对菌体检测的灵敏度。

2结果与分析

2.1 LAMP 扩增反应体系优化

2.1.1内引物、环化引物和外引物浓度优化。由图2A、a可知，在引物比为2∶2∶1、4∶4∶1、6∶4∶1、8∶4∶1时均能产生清晰的梯度性条带，从凝胶成像的条带亮度上可以看出，引物比为6∶4∶1与8∶4∶1时的条带相比引物比例2∶2∶1和4∶4∶1时产生的条带更加明亮；引物比为6∶4∶1与引物比为8∶4∶1时凝胶成像的条带亮度相当。根据使用较少的内引物产生相似的扩增效果，选择内引物、环化引物和外引物的比6∶4∶1(30 pmol∶20 pmol∶5 pmol)为LAMP扩增反应最佳引物比例。

2.1.2 扩增反应时间的优化。研究表明，环化引物的加入与未加入相比其LAMP反应时间缩短50%以上[23]，设定扩增反应时间梯度为15、30、45、60 min，以筛选玉米内州萎蔫病菌LAMP检测方法的最佳反应时间。由图2B、b可知，LAMP在扩增反应进行15 min即开始产生梯度性条带，当扩增反应进行到30 min即可产生清晰的梯度性条带，因此选择30 min作为 LAMP 扩增体系的最佳反应时间。

2.1.3 扩增反应温度的优化。由图2C、c可知，LAMP扩增反应在62、63、64 ℃可以产生清晰的梯度性条带，其中64 ℃时LAMP扩增产生的条带更明亮；在61 ℃和65 ℃产生的条带模糊不清。因此选择64 ℃作为LAMP扩增体系的反应温度。

2.2 特异性验证结果 利用TIANGEN细菌基因组提取试剂盒提取玉米内州萎蔫病菌、参比菌株的 DNA， 紫外分光光度计Nanodrop 2000 验证提取效果，取2 μl为模板分别进行LAMP扩增反应和PCR扩增反应，验证LAMP优化体系的特异性。由图3可知，只有以玉米内州萎蔫病菌为模板进行LAMP能产出清晰的梯度性条带，其他以参比菌株DNA为模板的LAMP扩增均没有出现梯度性条带。结果表明，该试验建立的针对玉米内州萎蔫病菌的LAMP检测方法特异性强。

2.3 灵敏度检测结果

2.3.1基因组DNA灵敏度。提取玉米细菌性枯萎病菌基因组DNA，通过NanodropTM超微量分光光度计测量DNA吸光值，计算DNA浓度为50 ng/μl，调整浓度至25 ng/μl， 10倍梯度稀释，进行LAMP扩增和普通PCR扩增，验证LAMP优化体系针对基因组的灵敏度。由图4A、a可知，LAMP检测体系检测灵敏度可达2.5×10-5ng/μl，即每反应体系需50 fg(2 μl，2.5×10-5ng/μl)模板，比普通PCR(图 4B)检测灵敏度(5 pg)高100倍。

2.3.2 菌体检测灵敏度。取100 ul玉米内州萎蔫病菌菌悬液原液，用双蒸水进行10倍梯度稀释，涂板测定玉米内州萎蔫病菌菌悬液浓度为1.8×109CFU/ml,分别取2 μl稀释液为模板进行LAMP扩增和普通PCR扩增反应，验证LAMP优化体系针对菌体的灵敏性。由图4D、d可知，LAMP检测体系检测灵敏度能够达到3.6 CFU(2 μl,1.8×103CFU/ml)，而普通 PCR的检测灵敏度为3.6×102CFU(2 μl,3.6×105CFU/ml)(图4E)。对比LAMP体系和普通PCR体系凝胶成像结果表明，LAMP 检测体系的灵敏度比普通 PCR 的灵敏度高100倍。

3结论与讨论

我国玉米产量和种植面积均居世界第二位，玉米在我国粮食生产中占据重要地位。从2010年起，我国出现玉米净进口态势，2012～2014年，3年玉米进口总量超过1 000万t。玉米内州萎蔫病菌随进口玉米传入我国的风险很高。目前针对玉米内州萎蔫病菌的检疫方法主要有分离培养法、酶联免疫法、常规PCR、TagMan-PCR、巢氏PCR、REP-PCR 基因指纹技术以及2种或2种以上方法的结合，以上方法或操作复杂、耗时较长或需要PCR等仪器的支持，无法实现基层检疫人员现场、快速检疫的要求，不利于推广。该试验采用环介导等温扩增技术(LAMP)，可以有效克服以上方法的不足，其反应过程仅需要金属浴小型装备的支持，且结果不需要通过电泳仪等设备可以直接目视或者加入荧光染料紫外照射观察，这有效克服了试验场地的限制。该研究结果表明，LAMP反应菌体检测灵敏度高达3.6 CFU，现场检测可以直接淋取菌液进行试验，有效弥补其他分子生物学实验菌体灵敏度不高，需提取基因组DNA进行检测，减少了操作的复杂性；同时LAMP检测反应时间缩短到30 min，大大提高了检测的效率。

该试验每个过程均重复3次，结果显示该方法具有可靠的稳定性和较高的重复性。研究表明LAMP检测玉米细菌性枯萎病菌体检测灵敏度在1 CFU以下[24]，该试验针对玉米内州萎蔫病菌的检测灵敏度能否进一步提高还有待进一步研究。另外，虽然该试验证实LAMP法反应具有很高的特异性，但针对玉米内州萎蔫病菌亲缘关系相近的不同亚种，如Clavibactermichiganensissubsp.sepedonicus、Clavibactermichiganensissubsp.michiganensis的特异性仍需进一步验证。

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