天星健骨胶囊对佐剂性关节炎大鼠足爪组织 MMP－2及 MMP－9表达的影响

天星健骨胶囊对佐剂性关节炎大鼠足爪组织MMP-2及MMP-9表达的影响

杨晓军苗文丽裴林于素静1郑惠军2

(河北省中医药研究院，河北石家庄050031)

摘要〔〕目的观察天星健骨胶囊对佐剂性关节炎大鼠足爪组织MMP-2、MMP-9表达的影响。方法采用注射弗氏完全佐剂制作大鼠佐剂性关节炎模型，将造模成功的50只SD大鼠随机分为模型组、天星健骨胶囊低、中、高剂量组 (0.4、0.6、0.8 g/kg)、地塞米松组 (2 mg/kg)各10只，另设正常组(10只)。观察各组大鼠足爪肿胀度；至28 d采用免疫组化法检测大鼠足爪组织中 MMP-2 和MMP-9蛋白的表达。结果模型组和正常组，肿胀度差异显著(P<0.01)，各治疗组肿胀度与模型组比较均有下降(P<0.05或P<0.01)，中药中、高剂量组MMP-2、MMP-9阳性密度明显降低(P<0.05或P<0.01)。结论天星健骨胶囊可明显改善佐剂性关节炎模型大鼠的症状，其机制可能与其下调MMP-2、MMP-9表达有关。

关键词〔〕天星健骨胶囊；佐剂性关节炎；基质金属蛋白酶-2；基质金属蛋白酶-9

中图分类号〔〕R285.5〔

基金项目：河北省科技支撑计划项目(No.11276103D-69)

通讯作者：裴林(1961-)，男，教授，硕士生导师，主任医师，博士，主要从事浊毒基础与临床研究。

1唐山市第四医院2唐山市卫生监督所

第一作者：杨晓军(1971-)，男，主治医师，主要从事骨病临床研究。

基质金属蛋白酶(MMPs)在类风湿关节炎(RA)关节骨及软骨的破坏中发挥重要作用〔1〕。MMP-2、MMP-9 是明胶酶，其作用的底物是关节软骨的重要组成成分。实验表明MMP-2、MMP-9 与 RA 的病情严重程度及关节破坏相关〔2，3〕。 本文通过观察天星健骨胶囊对佐剂性关节炎模型(AA)大鼠组织中 MMP-2 及 MMP-9 表达的影响，探讨天星健骨胶囊治疗RA的作用机制。

1材料与方法

1.1实验动物60只健康雌性SD大鼠，清洁级，起始体重为(200±20)g，由河北医科大学实验动物中心提供(合格证编号：810024)。适应性饲养1 w，自由饮食，12 h光亮/黑暗条件、23～26℃环境温度，单笼喂养。

1.2药物天星健骨胶囊由雷公藤、制南星、土茯苓、青风藤、薏苡仁、骨碎补等组成，中药饮片由河北省中医药研究院饮片厂提供，由河北省中医药研究院制剂室制成浓缩胶囊。地塞米松片为广东三才医药集团有限公司产品，批号：H44024276，规格：0.75 mg/片。

1.3试剂与仪器弗氏完全佐剂(FCA)由Sigma公司提供；MMP-2、MMP-9免疫组织化学成套试剂盒均购自北京中山公司；电脑快速冷冻石蜡切片机(KD-IIIC，中国)；生物显微镜(E-600，日本)；图像分析仪采用德国 Leica 公司生产的 DMIRB E 显微平台；MetaMorph 图像分析系统以及 Olympus 显微照相系统 (PM-10A，日本 OlympusChc 公司)等。

1.4方法

1.4.1造模建立与分组60只大鼠依据随机数字表分成正常组10只、免疫造模组50只。对每只动物进行标记。造模方法〔4〕为将大鼠固定，在每只大鼠左足垫皮下注射FCA 0.1 ml，正常组以同样方法同时注射等量生理盐水，然后每天观察药物反应。至造模第14天，将AA大鼠随机分为模型组、地塞米松组、天星健骨胶囊低、中、高剂量组，每组10只。

1.4.2给药方法于造模第14天开始，正常组、模型组灌服生理盐水(10 ml/kg)；天星健骨胶囊低、中、高剂量组分别以混悬液(生药含量0.4、0.6、0.8 g/kg)灌胃；地塞米松组混悬液(2 mg/kg)灌服。1次/d，持续至28 d。常规喂养，自由进食饮水。

1.4.3足肿胀度测量于造模后第14、21、28天，用足容积测量仪准确测量，并记录大鼠左侧足爪容积(以下排水毫升数计)，求出肿胀度(致炎后足爪容积一致炎前足爪容积)。

1.4.4免疫组化法检测大鼠足爪组织中 MMP-2和MMP-9蛋白的表达取大鼠左足跖部位的组织，用中性甲醛溶液固定，石蜡包埋,石蜡切片后常规脱蜡至水。在此步用体积分数为0.03的H2O2去离子水孵育10 min,进行抗原修复。以0.1 mol/L PBS洗涤5 min 3次。正常山羊血清工作液封闭,室温孵育10 min。倾去血清，滴加1∶100 稀释的一抗，对照组用磷酸盐缓冲液代替一抗作阴性对照。37 ℃孵育 2 h。以0.1 mol/L PBS 洗涤 5 min 3次。滴加生物素化二抗工作液,37℃孵育15 min。以 0.1 mol/L PBS 洗涤 5 min 3 次。滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，37 ℃孵育15 min。以 0.1 mol/L PBS洗涤 5 min 3次。DAB 显色。苏木精复染细胞核，封固。MetaMorph图像分析系统检测：随机检测5 个高倍视野(×200)，计算每个视野MMP-2和MMP-9的阳性面积比，取其平均值。阳性面积比为每个视野阳性占整个视野面积的百分比，以其作为阳性反应细胞密度(简称阳性密度)。

2结果

2.1天星健骨胶囊对AA大鼠足爪肿胀的影响模型组较正常组足爪肿胀度明显增加(P<0.01)；各药物治疗组均可明显抑制大鼠足爪肿胀,与模型组比较(P<0.05或P<0.01)。见表1。

2.2天星健骨胶囊对AA大鼠足爪组织中MMP-2、MMP-9 蛋白的影响模型组大鼠组织中MMP-2、MMP-9阳性密度高于正常组(P<0.01);与模型组相比，地塞米松组、天星健骨中、高剂量组阳性密度降低(P<0.01);天星健骨低剂量组与模型组相比有所改善，但无统计学意义(P>0.05)。见表2。

组别14d21d28d正常组0.293±0.0422)0.327±0.0152)0.335±0.0182)模型组0.485±0.0320.815±0.0280.971±0.022地塞米松组0.473±0.0670.614±0.0632)0.552±0.0392)天星健骨胶囊低剂量组0.478±0.0480.774±0.0421)0.832±0.0182)天星健骨胶囊中剂量组0.466±0.0620.663±0.0172)0.516±0.0522)天星健骨胶囊高剂量组0.463±0.0240.559±0.0382)0.411±0.0922)

与模型组比较：1)P<0.05，2)P<0.01

组别MMP-2MMP-9正常组0.10±0.141)0.05±0.231)模型组0.87±0.120.92±0.15地塞米松组0.25±0.211)0.12±0.191)天星健骨胶囊低剂量组0.75±0.190.83±0.12天星健骨胶囊中剂量组0.51±0.111)0.43±0.201)天星健骨胶囊高剂量组0.32±0.151)0.39±0.171)

与模型组比较：1)P<0.01

3讨论

MMPs 在 RA 关节骨及软骨的破坏中发挥重要作用〔1〕。MMP-2 和MMP-9 是其中一大类，又名明胶酶，相对分子质量分别为 72 000、95 000。由于其是构成细胞外基质(ECM) 降解最重要的酶系统，参与 EMC 的重塑、炎症反应、免疫应答等〔5〕，MMP-2和MMP-9对 RA的关节破坏作用包括：①直接降解软骨和骨质;破骨细胞表达的 MMP-9 已被证实对构成成熟骨的 ECM 的主要成分-不可溶性Ⅰ型胶原具有末端肽酶活性〔6〕，参与了RA的骨质吸收。②在血管生成有重要作用，可以输送炎症细胞到滑膜并为血管翳提供营养，微血管基底膜和间质成分被降解，为血管翳的进展创造空间。研究发现在 MMP-2、MMP-9 的作用下可导致慢性滑膜组织增生，表现为滑膜衬里层细胞增生，炎性细胞浸润，滑膜下细胞增生和炎性细胞浸润及滑膜下层血管生成，增生的滑膜组织向关节软骨面生长，形成血管翳〔7〕。

本实验结果提示天星健骨胶囊对AA大鼠的炎症有治疗作用,可能是与其下调组织中MMP-2、MMP-9的表达、抑制滑膜组织增生、抑制关节软骨侵蚀、控制血管翳生成有关。

4参考文献

1张育. 基质金属蛋白酶及组织金属蛋白酶抑制剂与类风湿性关节炎〔J〕. 国际内科学杂志，2007；34(7):418-20.

2Yamanaka HK，Makino M，Takizawa H，etal.Expression and tissue localization of membrane-types 1，2，and 3 matrix metalloproteinases in rheumatoid synovium〔J〕.Lab Invest，2000;80(5)：677-80.

3Giannelli G，Erriquez R，Iannone F，etal.MMP-2，MMP-9，TIMP-1 and TIMP-2 levels in patients with rheumatoid arthritis and psoriatic arthritis〔J〕.Clin Exp Rheumatol，2004；22(3):335-8.

4张均田.现代药理实验方法〔M〕.北京:北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1998：1383.

5Gillian M，Vera K，Susan A，etal.Matrix metalloproteinases in arthritic disease〔J〕.Arthritis Res，2002;4(suppl 3)：539-40.

6Okada Y，Naka K，Kawamura K，etal. Localization of matrix metallo-proteinase 9( 92-kilodalton gelatinase / type IV collagenase = gelati-nase B) in osteocllasts：implications for bone resorption〔J〕.Lab Invest，1995；72(3):311-22.

7Jackson C，Nguyen M，Arkel J，etal.Selective matrix metalloproteinase (MMP) inhibition in rheumatoid arthritis-targetting gelatinase A activation〔J〕.Inflamm Res，2001；50(4):183-6.

〔2013-01-07修回〕

(编辑赵慧玲/曹梦园)

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