镁离子对 CCl4肝损伤小鼠肿瘤坏死因子－α和 Caspase－3含量的影响

镁离子对CCl4肝损伤小鼠肿瘤坏死因子-α和Caspase-3含量的影响

孙设宗赵杰官守涛唐微刘兴林

(湖北医药学院生化与免疫学实室，湖北十堰442000)

摘要〔〕目的研究镁离子对四氯化碳(CCl4)致肝损伤小鼠肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和Caspase-3含量的影响。方法3月龄昆明种小鼠随机分为模型组和对照组(常规饲料，饮自来水)；镁离子低、中、高保护组(常规饲料，饮水中以MgSO4的形式分别加入10、20、40 mmol/L 的镁离子)；饲养10 d，第11天对照组腹腔注射豆油溶液，其余各组腹腔注射0.15% CCl4豆油溶液，24 h 眼球取血，分离血清测丙氨酸转氨酸(ALT)。处死小鼠，取出肝脏称重,计算肝体指数，冰浴下制备肝匀浆，测定谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、一氧化氮合酶(NOS)活性及丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)、一氧化氮(NO)、TNF-α、Caspase-3的含量。结果CCl4肝损伤模型组小鼠肝体指数增大、MDA含量增加，ALT、 NOS活性增高；GSH含量减少，GSH-Px活性降低，NO、TNF-α、Caspase-3的含量增高；不同浓度的镁离子保护组，能降低肝体指数、降低MDA含量和ALT、 NOS的活性；提高GSH含量，增加GSH-Px活性，降低NO、TNF-α、Caspase-3的含量(P<0.05，P<0.01)。结论镁离子具有对抗和清除自由基作用，提高抗氧化酶活性，抑制TNF-α的分泌，降低Caspase-3的含量，对CCl4肝损伤有保护作用。

关键词〔〕镁离子；肝损伤；肿瘤坏死因子(TNF)-α；Caspase-3

中图分类号〔〕R39〔

基金项目：湖北省教育厅科学技术研究项目(鄂教科〔2007〕4号B200724001)

通讯作者：唐微(1965-)，男，博士，教授，主要从事药用蛋白基因工程研究。

第一作者：孙设宗(1954-)，男，高级实验师，主要从事生化药理研究。

各种原因的肝病发病机制虽不尽相同，但与自由基引发氧化应激、生物膜的脂质过氧化、肿瘤坏死因子α(TNF-α)异常分泌及Caspase-3激活密切相关〔1～4〕。镁离子是生物体内第二大阳离子，是多种酶的辅酶。研究表明镁离子具有良好的抗氧化作用，对肝损伤有保护作用，但其机制尚需进一步探讨。本研究探讨镁离子对四氯化碳(CCl4)致肝损伤一氧化氮(NO)、TNF-α及Caspase-3含量的影响。

1材料与方法

1.1材料3月龄昆明种小鼠50只，雌雄各半体重32～36 g，由本院动物中心提供。丙二醛(MDA)、丙氨酸转氨酶(ALT)、谷胱甘肽(GSH)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、一氧化氮合酶(NOS)、一氧化氮(NO)、TNF-α、Caspase-3检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所，其余为国产分析纯生化试剂。ZS83- 1 型内切式组织匀浆机(浙西机械厂)，722S型分光光度计(上海第二光学仪器厂)，RA- 50 半自动生化分析仪(美国Technicon 公司)，酶标仪(上海第二光学仪器厂)。

1.2方法小鼠50只随机分为五组，每组10只，模型组及对照组：常规饲料，饮自来水；镁离子低、中、高保护组：常规饲料，饮水中以硫酸镁(MgSO4)的形式分别加入10、 20、40 mmol/L 的镁离子；饲养10 d，第11天对照组腹腔注射豆油溶液，其余各组腹腔注射0.15% CCl4豆油溶液(10 ml/kg),12 h后禁食不禁水， 24 h 眼球取血，分离血清，用速率法测ALT、处死小鼠，取出肝脏置冰生理盐水中洗净血液,用滤纸吸去水分称重，计算肝体指数(肝重/体重)，用pH 7.4 的磷酸盐缓冲液PBS 按1∶10稀释冰浴下匀浆，4 000 r/min 离心5 min，取上清液用双缩脲法测肝匀浆中蛋白质含量，用PBS 稀释成4 mg/ml蛋白，按试剂盒要求测GSH-Px、NOS活性及MDA、GSH、NO、TNF-α、Caspase-3的含量。

1.3统计学方法采用SPSS13.0软件进行方差分析。

2结果

2.1镁离子对CCl4肝损伤小鼠肝体指数、ALT活性、MDA含量的影响模型组与对照组比较，肝体指数增大、MDA含量和ALT活性升高(P<0.01)，说明造模是成功的。不同浓度的镁离子保护组能降低肝体指数、降低MDA含量和ALT活性，但降低MDA含量和ALT活性与镁离子浓度成比关系，与模型组比较有统计学意义(P均<0.05)。见表1。

2.2镁离子对CCl4肝损伤小鼠GSH含量及GSH-Px、NOS活性的影响与对照组比较，模型组GSH-Px活性下降、GSH含量降低、NOS活性升高(P均<0.05)；不同度的镁离子能提高GSH-Px活性和GSH含量、降低NOS活性，与模型组比较有统计学意义(P﹤0.01)。见表2。

2.3镁离子对CCl4肝损伤小鼠NO、TNF-α及Caspase-3含量的影响与对照组比较，模型组NO、TNF-α含量和Caspase-3活性明显升高；不同浓度的镁离子能降低NO、TNF-α含量和Caspase-3活性，与模型组比较有统计学意义(P均<0.05)。见表3。

组别肝体指数MDA(nmol/mg)ALT活性(U/L)模型组0.0505±0.00415.96±1.28234.77±31.68对照组0.0449±0.00812)4.05±1.682)29.81±11.022)镁离子低剂量组0.048±0.00484.78±1.781)198.13±19.222)镁离子中剂量组0.0474±0.00231)4.69±1.971)141.25±73.212)镁离子高剂量组0.0453±0.00182)4.17±1.632)122.15±65.872)

与模型组比较：1)P<0.05，2)P<0.01，下表同

组别GSH-Px(U/mg)GSH(mg/g)NOS(U/mg)模型组579.65±14.1611.69±0.883.49±1.02对照组608.36±4.762)15.17±1.612)1.48±0.372)镁离子低剂量组604.89±3.432)13.92±0.932)1.91±0.872)镁离子中剂量组603.21±12.312)13.38±0.422)2.61±0.392)镁离子高剂量组608.91±5.812)14.11±1.232)3.15±0.41

组别NO(nmol/ml)TNF-α(ng/ml)Caspase-3(μmol/L)模型组4.65±0.932133.76±17.3642.91±22.93对照组3.11±0.9262)107.62±13.872)6.78±3.8182)镁离子低剂量组3.79±0.3261)94.61±7.672)14.23±6.7352)镁离子中剂量组3.39±0.5922)110.27±8.812)18.95±15.812)镁离子高剂量组3.82±1.271120.72±8.891)12.65±5.6352)

3讨论

脂质过氧化代谢的终产物MDA，可直接激活Kupffer 细胞，使之分泌TNF-α等细胞因子；适量的TNF-α可调节机体的免疫功能，对维持机体的正常稳定状态及抵御各种致病因子有着重要的作用。而TNF-α的异常分泌又可作为机体炎症、损伤和休克的重要炎性介质，参与诱导细胞的凋亡过程〔5〕。TNF-α的作用主要有以下几个方面：①TNF-α可激活肝星状细胞进一步损伤肝细胞；② TNF-α可诱导NOS的基因表达增加NOS的活性，促进NO的合成；增加肝脏NO的含量，过量的NO能与氧自由基反应生成氧化性更强的超氧化亚硝基阴离子(ONOO-)进一步损伤肝细胞；另一方面NO 过高可直接抑制线粒体呼吸，使肝细胞内能量代谢障碍而引起肝细胞凋亡和坏死。③TNF-α能抑制线粒体融合蛋白基因2(Mfn2)表达,引起细胞线粒体损伤，抑制线粒体的呼吸功能并增加线粒体活性氧和过氧化脂质的形成〔6，7〕。本研究说明镁离子抗CCL4肝损伤的机制与抑制TNF-α的分泌有关。

许多疾病都与细胞凋亡正、负向精确调控失误有关，细胞过度凋亡或凋亡过度抑制时则引起疾病。各种原因的肝损伤、肝炎、肝肿瘤等疾病都与细胞凋亡存在着密切联系〔8〕。Caspase-3正常情况下以酶原的形式存在，氧化应激时产生的TNF-α，内毒素、线粒体损伤均可激活Caspase-3从而导致细胞凋亡的发生，因此Caspase-3与急慢性肝损伤密切相关〔9〕。

综上，镁离子可通过对抗自由基的生成，降低肝体指数、MDA含量和ALT活性；增加GSH的含量和GSH-Px活性，抑制TNF-α的分泌、降低NOS活性和NO的含量，抑制Caspase-3的活性，对CCl4肝损伤有保护作用。镁离子具有第二信使作用，但镁离子抑制TNF-α的分泌和Caspase-3的活性的作用机制，是否也存在信号传导途径还需进一步探讨。

4参考文献

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〔2013-07-15修回〕

(编辑安冉冉/曹梦园)