电针对阿尔茨海默病大鼠海马胶质细胞源性神经营养因子及受体的影响

电针对阿尔茨海默病大鼠海马胶质细胞源性神经营养因子及受体的影响

刘忠锦张海燕1孙丽慧1郎尉雅1孙忠平

(齐齐哈尔医学院第一附属医院，黑龙江齐齐哈尔161006)

摘要〔〕目的探讨电针对阿尔茨海默病(AD)大鼠海马胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)及受体GFR- a1表达的影响。 方法通过Morris水迷宫筛选56只健康Wistar大鼠，随机分为正常组、模型组、西药组和电针组，每组14只。正常组常规饮水和饲料，不给予任何处理。其余三组大鼠均采用聚集态Aβ25～35所致AD模型，模型组造模后不给予任何处理。电针组施以电针双肾俞、双太溪、双足三里、百会、大椎等穴位治疗。西药组采用盐酸多奈哌齐灌胃，疗程4 w。治疗后各组大鼠灌注固定后取海马，用免疫组化和RT-PCR检测大鼠海马GDNF及受体的表达。结果与正常组大鼠比较，模型组大鼠海马GDNF及其受体GFR-a1阳性细胞表达降低明显(P<0.05);与模型组比较，电针组和西药组大鼠海马GDNF、 GFR-a1阳性细胞及GDNF mRNA表达增加(P<0.05)。结论电针可能通过对AD大鼠海马GDNF及其受体GFR-a1表达增强的影响，对神经元起到保护作用。

关键词〔〕电针；阿尔茨海默病；胶质细胞源性神经营养因子

中图分类号〔〕R245.97〔

基金项目：黑龙江省教育厅科学技术研究资助项目(No.12521652 )

通讯作者：张海燕(1979-)，女，副教授，硕士，主要从事中西医结合防治老年痴呆的研究。

1齐齐哈尔医学院组胚教研室

第一作者：刘忠锦(1980-)，男，硕士，主治医师，主要从事中西医结合治疗老年痴呆的研究。

目前药物治疗阿尔茨海默病(AD)没有得到显著效果〔1，2〕，而且有很大的局限性。针刺具有疏通经络，促进气血运行，醒脑开窍的功效〔3〕，对大脑的功能重组和代偿起着重要作用。胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)是转化生长因子β超家族的新成员，促进神经元轴突的定向生长以及运动神经元损伤修复和神经再生等。本实验通过观察电针对AD大鼠海马GDNF及受体(GFR-a1)表达的影响，探讨电针改善AD学习记忆障碍的分子机制。

1材料与方法

1.1主要试剂和仪器盐酸多奈哌齐(江苏豪森药业股份有限公司，批号：H20030472)，β-淀粉样蛋白(Aβ)25～35(Sigma公司)，大鼠抗GDNF单克隆抗体(Santa Cruz)，羊抗大鼠GFR-al多克隆抗体(R&D)，RNA抽提试剂盒TrizolReagent(Gibco)，RT-PCR试剂盒(TaKaRa)，GDNF分子引物序列:正义5′-GACTCCAATGTGCCCGAAGA-3′，反义5′-CCTACCTTGTCACTTGCTAGCC-3′，该引物产生426 bp的cDNA片段,β-actin分子引序列:正义5′-ATGCCATCCTGCGTCTGGACCTGGC-3′，反义5′-AGCATTTGCGGTGCACGATGGAGGG-3′，该引物产生200 bp的cDNA片段由北京三博生物科技有限公司合成，十二烷基硫酸钠(SDS，上海生工生物工程公司)，焦碳酸二乙酯(DEPC，Fluka公司)。 脑立体定位仪(NARISHIGESN-2型),Morris水迷宫(中国医学科学院药物研究所),电针仪(上海华谊G6805-1A型)，光学显微镜(Olympus BX51,日本)。

1.2动物选择及分组清洁级健康4月龄雄性Wistar大鼠60只，体重200～220 g，由黑龙江中医药大学实验动物中心提供(批号：2011003)，室内常温下常规饲养，经水迷宫测试，筛选出其中56只，随机分为正常组、模型组、西药组和电针组，正常组常规饮水和饲料，不给予任何处理。其余三组大鼠均采用聚集态Aβ25-35所致AD模型，模型组采用造模后不给予任何处理。电针组采用造模后施以电针双肾俞、双太溪、双足三里、百会、大椎等穴治疗，用 0.25×0.25 mm2华佗牌无菌毫针针刺，连接G6805-1A型电针仪，电压为2 V，频率为30 Hz，强度以肢体局部轻微颤动为适。西药组采用盐酸多奈哌齐灌胃，每日0.6 mg/kg，疗程4 w。

1.3模型复制10%水合氯醛3 ml/kg使大鼠麻醉后，固定在脑立体定位仪上。消毒皮肤,剪毛，在头部做正中矢状切口，牙科钻孔器钻颅有突破感，坐标为脑表面下3.5 mm,前囟1.5 mm，矢状缝左右旁开1.5 mm。在每侧侧脑室注射10%链脲霉素10 μl。用微量进样器抽取2 μl Aβ25～35(用无菌生理盐水将其稀释成10 μg /pl)37℃孵育1 w，使其变为聚集状态。创口缝合饲养，3 d后重复注射，术后大鼠每天肌注青霉素4万单位预防感染〔4〕。

1.4各组大鼠标本的制备各组大鼠治疗4 w，麻醉后固定于鼠板上，行胸腹联合切口，切断肋骨、膈肌，暴露出心脏，在左心室插入灌注针头，快速灌入生理盐水500 ml冲出组织内血液，剪开右心耳，冲洗到肝脏变白，然后注入4%多聚甲醛,当大鼠尾巴、四肢僵硬为达到效果，取脑分离海马〔5〕。一侧海马保存至液氮罐内，一侧置于4%多聚甲醛中固定24 h，取海马标本，冠状切片，片厚4 μm，经乙醇脱水、二甲苯透明、浸蜡及石蜡包埋，连续切片，进行贴片，将附贴好的切片置于恒温箱内干燥。

1.5免疫组织化学检测GDNF和GFR-a1(SP法)石蜡切片脱蜡、水化后,磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗3次，微波修复抗原,每张切片加抗GDNF抗体或者GFR-a1抗体,4℃过夜，PBS冲洗3次，加入生物素标记的第二抗体室温下孵育10 min，再加入链霉菌抗生物素一过氧化物酶溶液室温下孵育10 min，PBS冲洗后加新鲜配制的二氨基联苯胺(DAB)溶液5～10 min，常规脱水透明,中性树胶封片。用Image-ProPlus分析软件进行图像分析,每组切片取10个视野测定积分吸光度,取平均值代表GDNF 和GFR-a1表达。

1.6RT-PCR测定测定大鼠海马GDNF mRNA各组大鼠海马组织PBS冲洗,匀浆后采用Trizol法获得RNA，RT-PCR反应按试剂盒严格操作,PCR反应结束后，取5 μl PCR产物(内标取2.5 μl)加2 μl(6倍)样品缓冲液混匀后进行2%琼脂糖凝胶电泳，100 V电泳30 min。琼脂糖电泳凝胶条带经Bio-Rad Quantity one 4.4.0图像分析系统采集电泳图像，并进行半定量分析，结果用基因扩增条带吸光度与内参照β-actin光密度值的比值表示。

2结果

2.1治疗后免疫组织化学检测GDNF和GFR-a1的表达与正常组大鼠比较，模型组大鼠海马GDNF和GFR-a1表达明显下降(P<0.05);与模型组比较，电针组和西药组表达明显增加(P<0.05)。见表1。

组别GDNF表达阳性细胞数(个/高倍视野)GFR-a1表达阳性细胞数(个/高倍视野)正常组109.62±7.911)113.57±8.131)模型组67.54±7.3578.16±7.26西药组91.27±6.731)97.98±7.151)电针组92.98±7.461)99.62±6.811)

与模型组比较：1)P<0.05

2.2治疗后RT-PCR测定各组大鼠GDNF mRNA比较与正常组大鼠比较，模型组GDNF mRNA含量明显降低(P<0.05);与模型组比较，电针组和西药组含量明显增加(P<0.05)。见图1。

1 正常组，2 模型组，3 电针组，4 西药组 图1　RT-PCR测定各组大鼠GDNF mRNA的表达

3讨论

神经营养因子是一类对神经系统发挥神经营养作用的非常规营养物质〔6〕,1993年在小鼠胶质细胞系B49中发现了GDNF，GDNF通过招募GDNF受体及其酪氨酸激酶蛋白形成复合物激活下游信号转导途径来实现生物学效应，GFR-a1与GDNF的亲和性最强。星形胶质细胞约占正常成人中枢神经系统细胞总数的40%，研究发现星形胶质细胞能释放GDNF等大量的活性物质,对胆碱能神经受损后具有保护作用，并能预防和延缓胆碱能神经元的退行性病变〔7〕。

祖国医学认为人到老年气郁、气虚,均可致血癖，而癖血入脑，精髓枯萎而痴呆。百会属于督脉，针刺百会可以激发督脉及其他经脉的经气，开窍醒脑，疏通脑络淤滞，起到治疗痴呆之功效。而太溪穴为补肾要穴，有调补肾气之功，肾藏精、生髓，髓充精足则脑之神明得用。国内外许多研究发现电针对于健忘和神智的恢复有较好的治疗效果〔8，9〕。

本研究表明电针刺激AD大鼠海马GDNF及其受体正向调节，进一步对受损神经元起到保护和修复作用，所以AD大鼠痴呆症状得以改善。这可能是电针能有效防治老年性痴呆的作用机制。

4参考文献

1Anitha M，Gondha C，Sutliff R，etal.GDNF rescues hyperglycemia-induced diabetic enteric neuropathy through activation of the PI3K/Akt pathway〔J〕.J Clin Inves，2006;116(2):344-56.

2Luis CA，Loewenstein DA， Acevedo A，etal.Mild cognitive impairment:directions of future research〔J〕.Neurology,2003;61(4):438-44.

3荆翔愚.针灸治疗老年性痴呆进展〔J〕.河南中医杂志，2010;30(4):415-7.

4Mansvelder HD,McGehee DS.Cellular and synaptic mechanisms of nicotine addiction〔J〕.J Neurobiol,2002;53(4):606-17.

5Wang XP,Ding HL.Alzheimer's disease: epidemiology,genetics,and beyond〔J〕. Neurosci Bull,2008;24(2):105-9.

6吴晓娟,魏明发,柴成伟,等.胶质细胞源神经营养因子在大鼠骨髓间充质干细胞神经分化中的表达〔J〕.实用儿科临床杂志,2009;24(23): 1806-8.

7马骏，王彦春，王述菊，等.电针对阿尔茨海默病模型大鼠海马区神经营养因子及其受体表达的影响〔J〕.针灸临床杂志，2010;26(7):63-6.

8徐秋玲,刘涛.电针对老年痴呆症大鼠海马 CaMKⅡ表达的影响〔J〕.时珍国医国药,2013;24(1):236-8.

9杨晓航,刘智斌,牛文民,等.嗅三针对血管性痴呆大鼠学习记忆功能及海马ChAT、 AchE活性的影响〔J〕.辽宁中医药大学学报,2010;12(7):40-2.

〔2013-07-11修回〕

(编辑袁左鸣)