微拟球藻中潜在C4循环对不同抑制剂、光质的响应

魏力

摘要：为了探讨微拟球藻C3、C4循环在碳固定过程中的角色和功能，通过对其基因组、转录组进行解析，发现微拟球藻IMET1中存在编码磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、苹果酸酶、丙酮酸磷酸双激酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶等C4 途径关键酶的基因。分析了关键C4基因的进化，并通过实时荧光定量PCR法检测了微拟球藻在不同光质条件下C4基因（磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶）表达量的变化。此外通过使用不同的化学抑制剂检测这些潜在C4基因对其的响应。结果表明，IMET1中存在细菌型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶，在系统同发育关系上，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因都与硅藻、褐藻进化关系很近。在白光、蓝光、红光等非生物胁迫条件下，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶的基因表达在蓝光下短期内会显著升高，而后相对表达又下调。在某些胁迫条件下，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、丙酮酸磷酸双激酶酶等活性的升高可能改变了微拟球藻IMET1碳代谢途径的走向，C4代谢途径功能加强。

关键词：微拟球藻；C4循环；抑制剂；转录动态

中图分类号： S917 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2015）10-0298-05

根据光合作用碳素同化的最初光合产物的不同，高等植物的光合作用分为3类：分别是C3植物、C4植物、景天酸代谢（crassulacean acid metabolism，CAM）[1]。高等植物中，绝大多数植物（约占90%）使用C3循环进行CO2固定，即经典的卡尔文循环途径，只有一些耐干旱植物（如高粱、玉米、稗草、黍类）才拥有C4循环。生长在极端干旱条件下的植物（如景天、仙人掌等）能利用CAM通路形式光合固碳[2]。与C3植物相比，C4植物具有较强的光合作用活性，它能通过碳浓缩显著提高固碳酶-核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶（rubisco）周围的CO2浓度，进而提高光合固碳效率，并且能够同时改善、提高氮和水的利用效率[3]。

目前，我国对浮游植物光合无机碳吸收机制的认识相对滞后，没有像高等植物一样明确分类。据报道，水生植物的某些种类（如Hydrilla、Egeria、Orcuttia、Eleocharis属）可以进行C4形式的光合作用， 但它们并没有大部分陆生C4植物拥有的Kranz结构。在某些非生物胁迫条件下，这些物种在叶绿体内能够利用NADP 苹果酸酶（NADP-ME）完成苹果酸脱羧反应并释放CO2，从而形成叶绿体内的CO2 浓缩机制（CO2 concentrating mechanism，CCM）。C3、C4 途径将在同一细胞中进行，而磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（phosphoenolpyruvate carboxylase，PEPC）和 rubisco分别定位在细胞质、叶绿体中起作用，这与C4陆生植物的C4循环存在很大不同[4]。水生植物黑藻（Hydrilla verticillata）具有C3 途径的气体交换和生化特征，但当暴露在低浓度的CO2 环境中10～12 d，会诱导产生C4 类型的CO2 浓缩机制[5]。此外，海洋藻类由于长期的进化适应仍通过低碳诱导的CO2 浓缩机制来增加主要的光合作用羧化酶rubisco 周围CO2 的浓度[6]。通过这个机制能够增加CO2 与O2 的比例，进而减少光呼吸过程中的能量浪费。海洋藻类光合作用的碳固定途径一般被认为是C3 途径，但是最近的同位素标记试验、基因组测序数据表明，藻类中也存在潜在的C4 途径，即CO2首先被固定形成四碳分子苹果酸或草酰乙酸，如海洋硅藻威氏海链藻（Thalassiosira weissflogii）单细胞中存在C4途径，在三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）中或许存在1个潜在的C4类似碳固定途径[7]。然而，1个介于C3-C4之间的碳固定途径被认为存在于假微型海链藻（Thalassiosira pseudonana）中。因此，在不同的硅藻中，多种类型的CCM机制或许存在。绿藻（Ostreococcus tauri）中已经发现了C4 光合作用的相关基因[8]。这些C4基因包括磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）、苹果酸酶（ME）、苹果酸脱氢酶（MDH）、丙酮酸磷酸双激酶。其中，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）是一种在维管植物、古细菌、细菌、蓝藻中广泛存在的胞质酶，它在HCO3-存在的情况下，催化PEP形成O2、Pi，它是高等植物同化碳的酶[9]。磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）催化PEPC逆反应，普遍存在于动植物、微生物细胞中。尽管环境生态因子对光合作用的碳吸收途径有较大影响，但是到目前为止，海洋藻类中有关这方面的认识仍是比较肤浅的。微拟球藻是单细胞光合微藻，广泛分布于海洋、淡水等环境水域。这一类微藻能够被广泛应用于生物燃料、生物碳减排、其他高附加值等生物技术工业中，因此，认识微拟球藻的生理、代谢途径是非常必要的。目前已经有多株微拟球藻完成了基因组测序，其中在基因组注释中发现有C4基因的存在[10-13]。为了深入探索环境对微拟球藻的无机碳藻吸收影响及潜在C4循环的作用，本研究从微拟球藻光合放氧对外源无机碳的响应入手，探讨微拟球藻、衣藻在不同抑制剂条件下的光合放氧及其表观无机碳亲和力，比较了在不同外界非生物环境胁迫（光质）条件下光合放氧的不同响应以及潜在C4基因的表达动态，旨在为微拟球藻在工业上遗传改良提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 藻种和培养条件

微拟球藻（Nannochloropsis oceanica） IMET1由美国马里兰大学陈峰老师友情馈赠，经反复分离纯化至无菌。培养基配方来自于美国亚利桑那州立大学胡强教授实验室修正后的f/2培养基，组成成分如下：35 g/L 海盐，1 g/L NaNO3，67 mg/L NaH2PO4·H2O，3.65 mg/L FeCl3·6H2O，437 mg/L Na2EDTA·2H2O，trace metal mix（0.0196 mg/L CuSO4·5H2O、0.012 6 mg/L NaMoO4·2H2O、0.044 mg/L ZnSO4·7H2O、0.01 mg/L CoCl2、0.36 mg/L MnCl2·4H2O）和 vitamin mix（5 μg/L维生素B12、5 μg/L Biotin、 1 mg/L Thiamine HCl）。正式开始试验前将N.oceanica IMET1在琼脂平板上活化，挑取单克隆藻落接种于液体培养基中，控制培养过程温度为25 ℃，连续光照，光照强度为50～85 μmol/（m2·s），通入空气或混有1.5%CO2的空气进行培养，连续活化培养3轮，再进行后续试验。在不同光质处理试验中，分别采用白光、蓝光、红光的光照LED灯进行试验。莱茵衣藻（CC124）购自衣藻资源中心，培养于TAP培养基，配方参考自衣藻资源中心。endprint

1.2 微拟球藻的生长参数测定

将在白光下培养至对数生长期的微藻接种到柱式反应器，接种后分别在蓝光、红光、白光下培养，每天定时取样1～3 mL测定藻液的D750 nm，同时测定光合作用效率（Fv/Fm），用Image-PAM （Walz GmbH，Germany）通过脉冲幅度调制测量微拟球藻活体光系统Ⅱ的荧光参数。先将样品暗适应15～20 min，测量最小荧光产额（F0），然后应用饱和脉冲法测量最大荧光产额（Fm），PSⅡ的最大光化学效率（Fv/Fm）计算公式如下：

Fv/Fm=（Fm-F0）/Fm。

1.3 不同抑制剂对微藻的处理

采用不同的抑制剂抑制潜在的C4相关基因编码酶（如磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶PEPC、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶PEPCK），调查这些抑制剂对微拟球藻光合作用活性的影响，进而探讨潜在的C4循环在微拟球藻的光合固碳中的功能。本研究中共使用了4种抑制剂：3-MPA、Rutin、Quercetin、Baicalein。其中，3-MPA是磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶PEPC的抑制剂，其余3种抑制剂都是磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶PEPCK。通过添加不同抑制剂后测定光合放氧速率来探讨其光合活性。

1.4 光合放氧速率的测定

采用液相氧电极方法测定光合放氧速率。离心收集对数生长期藻细胞，弃去上清，重悬于新鲜的培养基中，加入不同的化学抑制剂，取3 mL测定光合放氧速率。

1.5 微拟球藻潜在C4基因的分布比较、序列进化分析

微拟球藻潜在C4基因序列分别来自于GenBank和本实验室基因组、转录组测序，用NCBI 上的BLAST X程序（WWW.ncbi.nlm.nih.gov/blast）将这些序列与其他一些已知序列进行同源性比较，再用ClustalW进行比对，用Mega 4.0程序构建系统发育树。

1.6 微藻RNA提取和反转录制备cDNA

按照说明书的方法用Trizol试剂提取每种处理后的微拟球藻总RNA，用DEPC处理过的水溶解RNA。 用MoloneyMurine Leukemia Virus 反转录酶把RNA反转录成cDNA，用 Nannoview 对其浓度进行测量，随后进行实时定量PCR分析。

1.7 荧光定量PCR试验

用Roche的Light-cycle 480 Real-Time PCR 系统配合SYBR Green 荧光染料试剂盒对微拟球藻IMET1中潜在C4基因在不同光质胁迫条件下的转录动态进行实时荧光定量PCR反应。为了使选择的基因相对表达量标准化，选用actin基因作为内参基因。根据PEPC、PEPCK、actin基因序列，用Primer Express 3.0 设计定量PCR引物（表1）。每个基因的表达都进行3次独立重复，并且来自3个生物学重复。荧光定量PCR反应体系如下：10 μL 2×SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ、1.0 μL 10 pmol/L上游引物、1.0 μL 10 pmol/L下游引物、2.0 μL cDNA、6.8 μL去离子水。荧光定量PCR反应程序为：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 10 s，72 ℃ 40 s，40 个循环。采用2-ΔΔCT 方法分析实时定量PCR结果。

2 结果与分析

2.1 微拟球藻中潜在C4基因的分布情况

基于目前已经完成的微拟球藻属基因组，系统比较了C4基因在微拟球藻中的分布情况。通过比较发现，在微拟球藻IMET1、N.gaditana CCMP526、N.oceanica CCMP1779中都存在潜在的C4基因（PEPC、PEPCK、PPDK、NADP-ME、NAD-ME、MDH），在CCMP1779中不存在PEPCK基因（表2）。本研究关注的IMET1中存在所有潜在的C4基因，这就暗示我们它们或许也使用C4循环进行光合碳固定，也进一步提示我们需要探索这些潜在C4循环基因的功能，特别是在逆境条件下它们的功能。

2.2 潜在C4基因PEPC、PEPCK的序列进化分析

大多数高等植物中PEPC由多个拷贝构成，如在拟南芥、水稻中分别报道了4、6个，根据基因、蛋白结构可分为2种PEPC酶，分别是植物型PEPC、细菌型PEPC。笔者对微拟球藻IMET1中PEPC进行了进化分析。基因相似性分析表明，微拟球藻IMET1中存在1个细菌型PEPC酶，并且与相近物种硅藻、褐藻中的PEPC具有相对较高同源性，相似性为58%～65%。与微拟球藻N.gaditana有87%序列相似度（图1）。硅藻中的PEPC被认为参与C4循环，因此笔者推测，微拟球藻中的细菌型PEPC或许也参与C4光合固碳，需要进一步证实。

在不同物种中，PEPCK 在细胞内分布、特性明显不同，编码基因序列、结构存在差异。IMET1中的PEPCK与硅藻、褐藻存在很大的序列相似性，而与绿藻序列相似度较低（图2），这或许也暗示它潜在参与C4功能。

2.3 微拟球藻中潜在C4基因的转录动态

为了探讨潜在的C4循环在微拟球藻中的角色与功能，笔者进一步测试了微拟球藻中潜在C4基因在应对外界环境变化时它们的转录动态。光质影响植物光合活性，进而影响植物光合固碳效率，因此笔者试图从光质利用角度来阐述微拟球藻中潜在C4循环机制。通过荧光定量PCR试验，笔者研究了微拟球藻中潜在的C4基因在不同波长光质（波长约680 nm 红光、波长约450 nm蓝光、白光）下的表达状态，其中PEPC的表达在转移到蓝光条件下将被瞬时激活，从图3可以看出，3、6 h，相对于白光、红光，蓝光条件下PEPC的表达丰度是最高的；9、12 h，PEPC在蓝光下的表达丰度又降低，在白光条件下开始升高。笔者推测PEPC对光合固碳是有响应的。同样，笔者也关注了PEPCK的表达变化，发现也是在6 h的蓝光下表达丰度较高，因此，它的升高可能是在光合固碳中发挥作用。endprint

苹果酸酶是广泛存在于动物、植物以及原核生物的一类氧化脱羧酶。植物C4 型NAD-苹果酸酶（NAD-ME）和NADP-苹果酸酶（NADP-ME）是C4 光合途径的关键酶，催化苹果酸脱羧放出CO2，并产生丙酮酸，丙酮酸再生为PEP，使C4 途径得以循环进行，CO2 则被Rubisco 酶重新固定而进入卡尔文循环途径。PPDK是NADP-ME型植物C4光合途径中催化丙酮酸转化成CO2的原初受体磷酸烯醇式丙酮酸。鉴于它们在C4循环中的重要性，笔者也关注了它们的表达变化，发现在6 h蓝光下，它们的表达丰度明显高于白光、红光下的表达水平（图3）。因此，作为潜在的C4基因，它们也可能在光合固碳中起着重要角色。

2.4 微拟球藻IMET1在不同光质下光合活性

为了进一步认识微拟球藻在蓝光等不同光质下的生理反应与潜在C4的关系，笔者比较了微拟球藻在不同光质条件下，光合系统Ⅱ最大光合效率（Fv/Fm）的变化。结果表明，在蓝光条件下，微拟球藻的光合活性最高，红光条件下的光合活性最低（图4），这与潜在C4基因的表达或许存在相关性，可见，这些潜在C4基因影响微拟球藻光合活性，进而推测它们在微拟球藻固碳过程中发挥重要功能。

2.5 PEPCK酶抑制剂对植物光合作用活性的影响

为了进一步探讨潜在C4基因是否参与光合固碳，笔者采用不同的抑制剂去抑制潜在的C4相关基因编码酶（如磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶PEPC、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶PEPCK），调查这些抑制剂对微拟球藻光合作用活性的影响，进而探讨潜在的C4循环。尽管PEPCK酶广泛存在于微生物、藻、高等植物中，负责从丙酮酸到磷酸烯醇式丙酮酸的脱羧反应，参与糖异生过程，但是在一些高等植物（如玉米、高粱、黍类等）中，PEPCK酶被认为是C4循环中的重要酶。笔者采用PEPCK酶特异的抑制剂3-MPA（3-mercaptopicolinic acid），3-MPA已经被广泛用于PEPCK酶的抑制研究。比较微拟球藻、莱茵衣藻的PEPCK酶在特异抑制剂作用下，微拟球藻、莱茵衣藻光合作用活性变化，进而比较PEPCK酶在微拟球藻、莱茵衣藻生物功能的异同。通过抑制试验结果发现，当在反应体系中加入5 mmol/L 3-MPA 用于抑制PEPCK酶时，微拟球藻、莱茵衣藻的光合活性明显不同，微拟球藻的PEPCK酶被强烈抑制，莱茵衣藻的PEPCK酶被抑制不明显，说明微拟球藻、莱茵衣藻的PEPCK酶对抑制剂3-MPA表现出不同光合活性（图5）。通常认为莱茵衣藻的PEPCK酶不是参与C4，而是参与TCA循环的回补反应。可见，3-MPA能抑制IMET1中磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）羧化过程，因此微拟球藻IMET1中部分CO2的固定可能是由PEPCK负责的。

2.6 PEPC酶抑制剂对微拟球藻光合作用活性的影响

为了探讨潜在的C4基因（PEPC）编码酶在微拟球藻光合固碳中的角色与功能，笔者采用化学抑制剂抑制PEPC酶， 它催化磷酸烯醇式丙酮酸到丙酮酸，即PEPCK酶催化的逆反应。比较微拟球藻、莱茵衣藻的PEPC酶在特异抑制剂作用的情况下，微拟球藻、莱茵衣藻光合作用活性变化。结果表明，槲皮素对莱茵衣藻的PEPC酶作用不明显，光合放氧速率几乎没有发生变化，基本维持在4 μmol/（107个·h）水平，与未处理组没有显著差别 （图6）。对于微拟球藻而言，加入抑制剂后，光合放氧速率从5.5 μmol/（107 个·h）下降至 1.4 μmol/（107 个·h）。可见IMET1的PEPC酶活性显著被抑制，说明IMET1与莱茵衣藻的PEPC存在不同功能。从图6可以看出，微拟球藻在黄芩素作用下，光合放氧活性显著降低，光合作用活性从5 μmol/（107 个·h）降低到1 μmol/（107 个·h）。然而，微拟球藻在芸香苷水合物抑制试验中，光合放氧速率几乎没有受到影响。添加芸香苷抑制剂后，莱茵衣藻的光合放氧、光合活性几乎未受到影响，和对照组相比，处理组的光合放氧速率仍然保持在较高水平，这样看来微拟球藻、莱茵衣藻的PEPC酶在3个抑制剂作用下表现出不同的特征。通常认为，莱茵衣藻使用C3途径进行光合CO2固定，因此，笔者推测微拟球藻IMET1可能使用C4循环进行CO2固定。

3 结论

本研究从生理角度和转录水平探讨了微拟球藻潜在C4的机制，结果表明，微拟球藻IMET1中存在C4光合作用固碳途径，通过化合物抑制试验揭示C4途径中酶在IMET1与莱茵衣藻中可能起不同的功能，特别是在应对逆境过程中起作用， C4基因的表达分析表明，PEPC、PEPCK、ME、PPDK等在蓝光胁迫条件下比在正常生长条件下转录丰度明显升高。

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