草果果腐病拮抗产芽孢细菌的筛选与鉴定

郭建伟　罗冰　杨丽芬　杨建　田学军　刘艳红　胡锐菊

摘要：以草果果腐病镰刀菌作为指示菌筛选拮抗产芽孢细菌，结果表明健康果实比患病果实的细菌多样性高，但相对抑制率≥35%的高拮抗菌株均分离自病果，并通过形态学及生理生化特征鉴定出8株枯草芽孢杆菌、1株解淀粉芽孢杆菌、1株嗜碱芽孢杆菌、1株花园芽孢杆菌、1株苛求芽孢杆菌及3株革兰氏阳性产芽孢球菌。

关键词：镰刀菌；产芽孢细菌；草果生物防治

中图分类号： S432.4+2 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2015）10-0176-03

草果（Amomum tsaoko Crevost et Lemaire），又名草豆蔻，多年生常绿丛生草本植物，隶属姜科豆蔻属，主要分布我国云南、广西和贵州等省（区）局部地区；果实性温、浓香，具有健胃、消食、顺气、祛寒湿等药效，也是上好的烹调佐料[1]。云南南部、东南部和西南部的亚热带雨林种植广泛，萎蔫病、叶斑病、疫病等常见病害日益引起研究者的关注[2-4]；另据本团队调查，花腐病、果腐病、立枯病在云南红河州的屏边、元阳、绿春均有暴发，其中果腐病已遍及文山、红河、绿春、金屏、屏边多个县（区）的草果产区，常导致果穗腐烂、脱落，果实腐烂，叶片枯死，其病原菌为镰刀菌（Fusarium sp.）。

产芽孢细菌，尤其是药用植物内生菌在植物病害生物防治和促进植物生长方面有着重要的应用价值[5]；这类细菌突出的特征是能产生耐热抗逆的芽孢，有利于生防菌剂的生产、剂型加工及在环境中存活、定殖与繁殖[6]；目前应用广泛的产芽孢细菌种类有枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilies）、多黏芽孢杆菌（B.polymyxa）、蜡状芽孢杆菌（B.cereus）、蜡状芽孢杆菌蕈状变种（B. cereus var. mycoides）等[7]。因而，本研究拟从草果根际土壤及果实分离耐高温（80 ℃恒温处理30 min）细菌，继而筛选对果腐病镰刀菌具有高拮抗活性的菌株，再进行形态学及生理生化特征鉴定，重点筛选芽孢杆菌为后续生防菌剂的开发提供菌株来源。

1 材料与方法

1.1 供试材料

病原菌：草果果腐病镰刀菌（Fusarium sp.）菌株F1。

供试土样及草果果实：供试土样于2011年10月采自云南省红河州金屏县马鞍底乡草果种植区的患病植株根际，以无菌铲子刮去表层土壤，每个样点取15～30 cm深度的草果根际土30 g；供试草果果实于2012年7—8月采自屏边县石寨村、白沙村、仓房村、新现村及蒙自市岗坛子。

培养基：PDA、LB、硝酸盐还原试验培养基、淀粉水解试验培养基、葡萄糖蛋白胨液体培养基、西蒙氏柠檬酸盐培养基、牛奶培养基等[8]。

1.2 试验方法

1.2.1 耐高温细菌的分离、纯化 土样细菌分离：将土壤样品磨碎、混匀、过筛（100目），每份样品取2 g细土样放入盛有18 mL无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶中，120 r/min室温振荡1 d，使土样分散并与水混合，置于80 ℃水浴30 min以杀死微生物菌体和其他杂菌保留芽孢[9]。热处理后静置 5 min，吸取1 mL土壤悬液加入盛有9 mL无菌水的大试管中充分混匀，再吸取1 mL加入另一盛有9 mL无菌水的大试管中摇匀，以此类推制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5等不同稀释度的土壤溶液[8]。取各梯度土壤悬液涂布于LB培养基中，每个梯度3次重复，置于32 ℃恒温培养箱中培养48 h。

果实内生细菌的分离：剪取健康草果或果腐病病果的健康部位，采用郭建伟等的方法[9]进行表面消毒，即先以75%乙醇消毒5 min，再转入10%次氯酸钠溶液中消毒8 min，冲洗2～3遍后用无菌剪刀剪取5 g，放入研钵中加入少量无菌水、石英砂快速研磨，研磨之后放入无菌烧杯中加20 mL无菌水溶解，置于80 ℃水浴30 min[10]。热处理后静置5 min，取上清液30 μL稀释100倍（相当于总共稀释500倍）后取30 μL涂布于牛肉膏蛋白胨培养基中，每份样品3个重复，置于32 ℃恒温培养箱中培养48 h。

纯化：待长出菌落后，根据菌落边沿是否整齐、光滑、中央是否突起、正反面颜色挑取不同的菌体划线，35 ℃恒温培养24～48 h后根据菌落形态及镜检菌体形态确定是否为纯菌落，若不纯则继续划线分离。

1.2.2 根腐病拮抗菌株的筛选 将细菌纯菌株以三点接种法与病原菌接在加有蛋白胨的PDA培养基上，28 ℃恒温培养7 d；测量抑菌圈半径（抑菌圈半径是病原菌菌落半径减去病原菌接种点到凹痕的距离），以不接种细菌的平板作对照测量病原菌半径，根据测量结果计算相对抑菌率（相对抑菌率=抑菌圈半径/病原菌半径×100%）[11]。

1.2.3 根腐病高拮抗菌株的形态及生理生化鉴定 对相对抑菌率≥35%的拮抗菌株进行革兰氏染色、芽孢染色、耐盐、耐高温、V.P试验、厌氧性试验、柠檬酸盐利用试验、接触酶试验、硝酸盐还原试验、淀粉水解试验、酪素水解试验等形态观察及生理生化特征鉴定[8]。

2 结果与分析

2.1 耐高温细菌的分离

从采集自不同地方的草果果实及土壤样品中经80 ℃处理、稀释涂布、划线培养等方法共分离纯化得到208株细菌。由表1可见，健康果实比病果的细菌数量更为丰富；细菌分布具有一定的地方差异性，屏边县白沙村健康果实、病果的细菌多样性最高，新现村健康果实、病果的细菌多样性最低。

2.2 根腐病拮抗菌株的筛选

经对峙培养法，从208株细菌中筛选出35株具有一定抑菌活性的菌株，其中屏边石寨村草果果实细菌中筛选到8株拮抗菌，6株相对抑菌率≥35%；白沙村筛选到7株拮抗菌，3株相对抑菌率≥35%；新现村筛选到2株拮抗菌，1株相对抑菌率≥35%；仓房村筛选到5株拮抗菌，2株相对抑菌率≥35%；蒙自岗坛子村草果果实细菌筛选到5株拮抗菌，2株相对抑菌率≥35%；金平县马鞍底乡果梗、果实均感染果腐病镰刀菌的根际土壤细菌中筛选到8株拮抗菌，相对抑菌率均低于35%（表2）。相对抑菌率≥35%的拮抗菌株均分离自患病草果果实，可能因为健康草果样品较少、细菌多样性高但优势种群少，不利于拮抗菌株的筛选。endprint

2.3 果腐病高拮抗菌株的鉴定

参照文献[8]，经形态学与生理生化鉴定，PSB-1、PSB-2、PSB-13、PSB-17、PBB-11、PCB-9、PCB-10、MGB-6等8株菌为枯草芽孢杆菌（B. subtilis），PBB-19初步鉴定为解淀粉芽孢杆菌（B. amyloliquefaciens），PSB-8初步鉴定为嗜碱芽孢杆菌（B. alcalophilus），MGB-7初步鉴定为花园芽孢杆菌（B. horti），MGB-16初步鉴定为苛求芽孢杆菌（B. fastidious）；另有PSB-31、PBB-12、PXB-14 等3株菌，均产圆形或椭圆形芽孢，革兰氏阳性、接触酶、硝酸盐还原、V. P反应、淀粉水解、酪素水解均为阳性，能耐5% NaCl及40 ℃以上高温，除PXB-14柠檬酸盐反应阴性外其余2株为阳性，仅能鉴定到革兰氏阳性产芽孢球菌（如表3所示），具体属、种分类地位尚须进一步研究。

本研究以80 ℃处理30 min筛选草果果腐病产芽孢拮抗菌，筛选到的15株相对抑制率≥35%的拮抗菌株均能产芽孢，表明这种筛选产芽孢细菌的方式是有效的。

3 结论与讨论

内生菌定植于植物组织内部不易受环境条件影响而成为重要的微生物农药、增产菌，根际微生物是定殖于植物根际能直接或间接促进植物生长的微生物[12]。由于草果在根际萌花并结果，草果果实极易受到周围及根际土壤、果实表面微生物的影响，因而本研究为扩大筛选防治草果果腐病并利于加工生防菌剂的菌株来源，选择健康及患病草果、病株根际土壤筛选耐高温细菌，从13份样品中共筛选到208株细菌，35株对果腐病镰刀菌具有一定的室内抑制作用，其中相对抑制率≥35%的有15株，经鉴定均能产芽孢，大部分属于芽孢杆菌属甚至枯草芽孢杆菌，这与陈波等的研究结果[13]基本一致但有所差异。差异的原因可能在于：一是采样地点环境及管理的差异性，本研究中草果种植于保留松树等部分山林树种或具有人工栽培旱冬瓜作为遮阴植物的山坡，与同因镰刀菌引起的香蕉种植园相比排水性好却极少施肥，对土壤微生物及草果果实内生、附生微生物种群的人为干扰较少；二是分离样品的差异性，本研究采用草果果实、病株根际土壤分离耐高温拮抗微生物，比后者香蕉健康及枯萎病植株根际细菌的丰度高但排除了葡萄球菌属等不产孢细菌类群。在产芽孢细菌的分离技术方面与王松等的研究[5]相比，本研究先采用高温处理去除其他非产芽孢细菌的干扰，分离效率更高，但后者在分离细菌后进行芽孢染色观察排除非产芽孢细菌的干扰，也提高了分离效率，若结合2种处理筛选拮抗产芽孢细菌，可能分离效率更高。

PSB-8、PSB-13、PBB-12、PCB-10、MGB-7、MGB-16对草果果腐病镰刀菌的相对抑菌率均大于60%，除PBB-12外均属于芽孢杆菌属，而PBB-12属于革兰氏阳性产芽孢球菌，既具有高拮抗性又都具有可抗逆境的芽孢，便于开发抗逆性强、耐贮存的生防菌剂，因而均具有较好的应用前景。有研究表明大量的根际有益微生物具有固氮、解磷、产生植物激素等促进植物生长和防治病害的能力，内生细菌主要为兼性内生的土壤细菌，目前还不清楚其促生长机制是单个微生物还是多种微生物类群的作用[14]。本研究虽未从病株根际土壤筛选到高拮抗性的产芽孢细菌，但数量多达8株，因而根际土壤拮抗产芽孢细菌也具有一定的应用潜能。

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