一种便捷高产的辣椒疫霉菌游动孢子产生方法

许亚池+王述彬+刁卫平+刘金兵+潘宝贵+郭广君+戈伟+刘娜

摘要：辣椒疫霉菌游动孢子的形成是辣椒疫病发生的前提，疫霉菌产孢条件的优化对辣椒疫病抗性育种具有重要意义。本试验对V8培养基的浓度、黑暗培养时间及无菌水处理等条件进行探索，以期获得辣椒疫霉菌游动孢子产生的最佳条件。结果表明：5% V8培养基最适合辣椒疫霉菌菌丝生长及产孢，产孢量可达100万个/mL，在光照试验中发现5 d黑暗处理时菌丝生长浓密且在光照条件下易于产孢。结果还发现，无菌水对产孢量有重要作用，黑暗处理后加入适量无菌水进行光照能够大大提高产孢量，最高产孢量可达750万个/mL。本试验简化了辣椒疫霉菌的培养，获得了游动孢子最佳产孢条件，为辣椒抗疫霉病研究奠定了基础。

关键词：辣椒；疫霉菌；游动孢子；产孢条件

中图分类号：S436.418.1+9 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2015）10-0172-02

辣椒疫病是由辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici）所引起的世界性病害，可造成幼苗猝倒、茎秆枯死和果实腐烂。辣椒疫霉菌最早由美国学者 Leonian于 1922 年分离并定名为Phytophthora capsici[1]，属鞭毛菌亚门（Mastigomycotina ）卵菌纲（Oomycetes） 霜霉目（Peronosporales）疫霉属（Phytophthora）真菌[2]。辣椒疫病于1918年在美国首次发生后并迅速传播至整个世界，我国也于20世纪50年代在江苏发现辣椒疫病的发生[3]。目前在我国各地均有发生，是我国辣椒生产上的主要病害之一。在辣椒种质资源疫病抗性评价与抗性相关基因表达及克隆等相关研究中，需要预先诱发出大量疫霉菌游动孢子作为接种菌源，而对辣椒疫霉菌产孢条件和游动孢子释放条件的优化是上述研究的前提。鉴于目前辣椒疫霉菌培养及产胞条件研究结论复杂多样，还未有一致的标准和方法，本试验选用混合蔬菜汁配制的改良V8培养基，对辣椒疫霉病菌丝培养和产胞过程中的光照、水分等因素进行研究，探索辣椒疫霉菌最佳产孢条件，旨在简化辣椒疫霉菌培养及游动孢子产生过程，为辣椒疫病抗性育种研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

试验所用的辣椒疫霉菌来自江苏省农业科学院资源与环境研究所，金宝汤V8 100%混合蔬菜汁饮料购于金宝汤亚洲有限公司。

基本培养基：琼脂粉10 g+碳酸钙1.0 g，加蒸馏水定容至500 mL，120 ℃高压蒸汽灭菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 V8培养基配比对菌丝生长及产孢影响 配制5%、10%、15%、20%等4种浓度的V8培养基，编号为1、2、3、4，以基本培养基作为空白对照组，编号为0，每组3次重复。将供试辣椒疫霉菌切块转接到上述5种培养基上，置于28 ℃暗培养5 d后记录菌落直径，再移至28 ℃全光照条件下培养 5 d，10倍显微镜下观察孢子囊，记录孢子囊数，然后诱导孢子囊释放游动孢子并计算浓度。

1.2.2 黑暗培养时间对菌丝生长及产孢影响 将辣椒疫霉菌接种于5%V8培养基上，28 ℃黑暗培养，设置3、4、5、6 d黑暗处理，编号为3、4、5、6，以全光照作为空白对照，编号为0，每组3次重复。培养后3 d开始依照试验设置将黑暗处理的培养皿移到全光照条件下，培养后6 d时记录菌落直径，10 d 后在10倍显微镜下观察孢子囊，记录孢子囊数，然后诱导游动孢子囊释放游动孢子并计算浓度。

1.2.3 水处理对产孢影响 取28 ℃黑暗培养5 d后的疫霉菌，以全光照不加无菌水为对照组，以全光照加入10 mL无菌水为处理组，每组3个重复。5 d后诱导孢子囊释放游动孢子并计算浓度。

1.2.4 菌落直径数据统计 菌落直径（cm）=3个培养皿菌落直径之和/3。

1.2.5 疫霉菌孢子囊数据统计 10倍显微镜下随机选取10个视野，观察记录孢子囊数并求出1个视野的平均孢子囊数：1个视野的平均孢子囊数（个）=10个视野总孢子囊数/10。

1.2.6 诱导孢子囊释放游动孢子及其浓度计算 在培养皿内加入10 mL无菌水，4 ℃冰箱处理30 min，取出置于室温 30 min，冲洗下白色菌落，吸取等量孢子悬浮液，10倍显微镜下利用25×16规格血球计数板统计并计算游动孢子浓度：游动孢子浓度（个/mL）=5个中方格内游动孢子数/80×400×10 000。

2 结果与分析

2.1 V8培养基配比对菌丝生长及产孢影响

辣椒疫霉菌5 d黑暗培养5 d光照培养后在显微镜10倍视野下镜检，发现0号偶尔有孢子囊出现在视野中，菌丝短而稀疏；1号5%V8试验组菌丝较密，接种块中央附近孢子囊出现较少，边缘孢子囊多，1个视野中平均有50个边缘孢子囊；2号10%试验组、3号15%试验组平均20、40个；4号20%试验组的中央、边缘孢子囊个数差异不明显，1个视野中平均3个孢子囊。菌落直径与血球计数板所得游动孢子浓度见图1。由图1可以看出，1号5%V8培养基最有利于辣椒疫霉菌菌丝生长与产孢。

2.2 黑暗处理时间对辣椒疫霉菌菌丝生长及产孢的影响

辣椒疫霉菌经过0、3、4、5、6 d黑暗处理后在培养后10 d 于10倍显微镜下镜检，结果发现，0 d处理菌丝稀少，稀疏地在培养基上生长，1个视野中平均2个孢子囊；3 d处理菌丝稀疏，1个视野中平均4个孢子囊；4 d处理菌丝较3 d处理浓密，1个视野中平均90个孢子囊；5 d处理菌丝成棉絮状，但边缘较少，1个视野中平均140个孢子囊；6 d处理菌丝与5 d处理差异不大，但1个视野中平均15个孢子囊。由图2可以看出，在3 d黑暗处理中辣椒疫霉菌虽然菌落直径最大，但其菌丝较5 d黑暗培养的菌丝不够浓密，并且光照处理后产孢效果没有5 d黑暗培养的强，综合选择5 d黑暗培养作为最佳黑暗培养时间。endprint

2.3 全光照时加入无菌水对游动孢子释放的影响

辣椒疫霉菌经过5 d黑暗培养和5 d光照培养后与奥林巴斯显微镜10倍视野下观察（图3、图4），经血球计数板计数得到加入无菌水的游动孢子浓度高达750万个/mL，未加入无菌水的游动孢子浓度为50万个/mL。在加入无菌水的试验组中发现，孢子囊一旦成熟就会在水的作用下释放游动孢子，游动孢子聚集在菌丝附近形成游动孢子树的现象（图5）。

3 结论与讨论

在以往的研究中，对辣椒疫霉菌产孢所适宜的培养基和

诱导方法存在不同观点。王晓敏等发现，胡萝卜培养基适合辣椒疫霉菌菌丝生长和游动孢子囊产生[4-6]；刘正坪等研究发现，在马铃薯+番茄、PV8上疫霉菌菌丝生长状况最佳[7]；而徐作珽等认为V8培养基营养丰富，能很好地促进辣椒疫霉菌孢子囊的产生，V8培养基较利马豆培养基、燕麦培养基和胡萝卜培养基、PDA等具有营养元素稳定、制作简单方便等优点[8]。本研究在有关V8培养基对辣椒疫霉菌培养的报道介绍下，利用V8混合蔬菜汁来配制不同浓度的培养基，发现5%配比最有利于菌丝生长及产孢。

张政兵等发现，辣椒疫霉菌菌丝生长对光照不敏感，但孢子囊的产生需要光照[9]。有学者认为在光照培养诱导产孢之前需要黑暗培养，该过程作用是为辣椒疫霉菌产孢积累营养物质，但对于黑暗培养的时间还未见研究。本试验结果发现，光照处理相对黑暗处理有抑制菌丝生长的现象，导致在全光照下培养的菌落直径较小，气生菌丝稀疏；并且发现菌落直径与产孢量并不存在正相关关系，菌落直径大的产孢量不一定大；本试验在辣椒疫霉菌产孢需要光照这一观点上与前人结论一致。在光照培养诱导产孢之前需要黑暗培养，先增加疫霉菌的营养生长，王晓敏推测可能由于营养生长积累了为产生孢子所需的养分，但过分生长是不利于产孢的[4]。本试验为探索黑暗培养时间进行比较试验，得出5 d黑暗处理的效果最好，菌丝生长浓密，光照培养后产孢较多。

辣椒疫霉菌孢子囊在16～28 ℃下多为间接萌发，即在水中孢子囊萌发释放游动孢子，在30 ℃以上时多为直接萌发，即在湿度较低时，孢子囊萌发产生芽管[10]。辣椒疫霉菌侵染寄主的典型过程是通过游动孢子完成侵染的，所以研究水对于游动孢子产生及释放的影响具有重要意义。侯全刚等一致认为，连续光照有利于辣椒疫霉菌产孢[11-12]，但在全光照条件下是否加无菌水培养少有研究，本研究得出水对游动孢子的释放有重要作用，与未加无菌水对照组相比游动孢子浓度高出1个数量级。简化游动孢子释放程序是本研究最大的创新，选择V8混合蔬菜汁来代替单一培养基，加之研究水对产孢影响得出最简化的产孢条件，增加了游动孢子的释放量，为辣椒疫病研究奠定了基础。

参考文献：

[1]Leonian L H. Stem and fruit blight of pepper caused by Phytophthora capsici[J]. Nov Phytopathology，1922，12：401-408.

[2]许志刚. 普通植物病理学[M]. 北京：中国农业出版社，2000.

[3]周启明. 辣椒疫霉病的调查研究[J]. 中国蔬菜，1981（1）：40-43.

[4]王晓敏，巩振辉，逯红栋，等. 辣椒疫霉菌孢子诱导技术研究[J]. 西北农业学报，2006，15（2）：59-62.

[5]兰成忠，刘裴清，李本金，等. 辣椒疫霉菌产孢培养基及诱导方法筛选[J]. 热带作物学报，2013，34（9）：1776-1 780.

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[7]刘正坪，张锦秀，张进文，等. 青椒疫病病原菌生物学特性测定[J]. 内蒙古农牧学院学报，1995，16（3）：32-36.

[8]徐作珽，李 林，魏道君，等. 大棚辣椒疫病菌的分离培养及药剂防治[J]. 植物保护，1999（2）：30-32.

[9]张政兵. 辣椒疫霉菌生物学特性及辣椒疫病的化学防治研究[D]. 长沙：湖南农业大学，2004.

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[11]侯全刚. 不同培养条件对循化线辣椒疫霉菌产孢量的影响[J]. 安徽农业科学，2011，39（23）：14178-14179，14182.

[12]李立凤，李小梅，张景涛. 辣椒疫霉菌生长和产孢条件的研究[J]. 东北农业大学学报，2010，41（10）：139-142.张响英，唐现文，董然然，等. 日粮蛋白质水平对狮头鹅繁殖性能及相关激素水平的影响[J]. 江苏农业科学，2015，43（10）：259-261.endprint