多杀菌素对亚洲玉米螟碱性磷酸酯酶和酯酶同工酶的影响

徐志红　李俊凯

摘要：研究多杀菌素对亚洲玉米螟碱性磷酸酯酶、酯酶同工酶的影响。结果表明，离体时多杀菌素不影响亚洲玉米螟碱性磷酸酯酶活性，但在活体时处理48 h后显著抑制碱性磷酸酯酶的活性；离体时多杀菌素对亚洲玉米螟酯酶同工酶活性并无影响，但是在活体时酯酶同工酶E4、E5、E6酶带受到明显抑制。

关键词：多杀菌素；亚洲玉米螟；碱性磷酸酯酶；酯酶同工酶

中图分类号：S435.132 文献标志码：A 文章编号：1002-1302（2015）10-0149-02

酯酶是昆虫对杀虫剂进行代谢的最重要酶系之一，不同酯酶活性的升高或轭合作用的增强是多种昆虫对拟除虫菊酯和有机磷类杀虫剂产生抗药性的重要原因[1-2]。在已进行抗性研究的昆虫中，其抗性机理几乎涉及酯酶的代谢作用[3]，磷酸酯酶在水解有机磷农药和拟除虫菊酯中起着重要作用[4]。研究开发作用机理新颖的杀虫剂是害虫抗性治理的最有效方法。多杀菌素（Spinosad）是一种作用机理独特的杀虫剂，是Spinosyn A和Spinosyn D的混合物（前者占80%，后者占20%），已经确认它作用于害虫的神经系统。Salgado认为，多杀菌素作用于烟碱型乙酰胆碱受体（nAChR）[5]；Watson的研究表明多杀菌素也作用于γ-氨基丁酸受体（GABA）[6]；王光峰等研究了多杀菌素对甜菜夜蛾羧酸酯酶的影响，发现多杀菌素在离体时对羧酸酯酶无抑制作用，但在活体时能诱导虫体内羧酸酯酶活性增强[7]。笔者所在课题组研究发现，Spinosyn A对辛硫磷有弱的增效作用[8]，这种增效作用可能是与有机磷代谢相关酶的活性被多杀菌素抑制所致，因此多杀菌素对碱性磷酸酯酶和酯酶同工酶影响的研究显得尤为必要。本研究以同样作用于GABA的阿维菌素为对照药剂，探讨Spinosyn A对亚洲玉米螟5龄幼虫碱性磷酸酯酶、酯酶同工酶的影响，以期有助于阐明该药剂的毒理机制。

1 材料与方法

1.1 供试昆虫

亚洲玉米螟（Ostrinia furnacalis）按周大荣等的方法[9]室内人工累代饲养，温度（26±2） ℃，光照度2 000 lx。

1.2 试验试剂

Spinosyn A：浓度为963%，由美国陶氏益农公司提供原粉；对硝基苯基磷酸二钠：生工生物工程（上海）股份有限公司；对硝基酚：天津化学试剂一厂；其他试剂均为国产分析纯。

1.3 对硝基酚标准曲线的制作

称取0.013 9 g对硝基酚，用1 mL丙酮溶解，加水定容至100 mL，浓度为1 mmol/L，用时再用蒸馏水稀释1倍，即成05 mmol/L对硝基酚标准溶液。分别取0.2、0.4、0.6、08、1.0 mL 0.5 mmol/L对硝基酚标准溶液，加入2 mL 01 mol/L NaOH，混匀后在400 nm波长处测吸光度，重复3次，取平均值，以对硝基酚（μmol）为横坐标、D400 nm值为纵坐标，绘制对硝基酚标准曲线并计算回归方程。

1.4 试虫处理和酶源制备

取5头亚洲玉米螟5龄初幼虫，用蒸馏水将体表冲洗干净，滤纸吸干，置于5 mL 0.05 mol/L碳酸钠缓冲液（pH值99）中匀浆30 s，于4 ℃、 3 000 r/min离心15min，取上清液作酶源。活体试验同样取5龄初孵幼虫，点滴处理其前胸背板，每头点滴1 μL以丙酮为溶剂的不同浓度的Spinosyn A药液，对照组（CK）仅用丙酮，常规条件下饲养，24、48 h后取出制备酶源。

1.5 碱性磷酸酯酶活性测定方法

碱性磷酸酯酶活性测定参照邱明生等的方法[10]，略加改进。碱性磷酸酯酶活力测定的反应混合液为2.3 mL 0.05 mol/L 、pH值9.9碳酸钠缓冲液，0.5 mL 7.5 mmol/L对硝基苯基磷酸二钠和0.2 mL酶液（蛋白量约100 μg）。以 1 mg 蛋白1 min生成的对硝基酚量表示酶的比活力，单位为 nmol/（mg·min）。

1.6 Spinosyn A对亚洲玉米螟酯酶同工酶的影响

1.6.1 酶源制备 制备酶源时取10头亚洲玉米螟5龄幼虫，于3 mL 0.1 mol/L磷酸缓冲液（pH值7.0）中冰浴整体匀浆，然后在4 ℃、3 000 r/min离心10 min，纱布过滤上清液，于10 000 r/min离心10 min，取上清液作酶源备用。离体酶活性试验药剂处理同上，处理后按酶源 ∶ 40%蔗糖 ∶ 0.03%溴酚蓝=2 ∶ 1 ∶ 1混匀，迅速点样进行电泳。

1.6.2 酯酶同工酶电泳 凝胶制备和电泳检测参照慕立义的方法[11]，并略有修改。分离胶浓度采用10%，缩胶浓度为25%，用垂直板状电泳于冰箱中电泳，电压150 V，起始电流10 mA，待指示剂前缘进入浓缩胶，电流加大并恒定于20 mA，样品蛋白量30 μg，电泳结束后以乙酸-α-萘酯为底物、以坚牢兰B为显色剂，37 ℃水浴染色15 min，然后用7%冰乙酸脱色、固定。

2 结果与分析

2.1 Spinosyn A对亚洲玉米螟碱性磷酸酯酶离体和活体活性的影响

不同浓度的Spinosyn A对亚洲玉米螟5龄幼虫碱性磷酸酯酶离体和活体活性影响如表1、表2所示。

由表1可知，从Spinosyn A对亚洲玉米螟碱性磷酸酯酶的抑制率上看，各处理组与对照组相比都有微弱的激活，但各处理组之间无太大差异，这表明Spinosyn A对亚洲玉米螟碱性磷酸酯酶离体活性虽有影响，但Spinosyn A并不直接作用于亚洲玉米螟碱性磷酸酯酶。

由表2可以看出，经Spinosyn A处理24 h之后，处理组与对照组的碱性磷酸酯酶比活力都有了明显变化，低浓度时（0.1 μmol/L）碱性磷酸酯酶被诱导活化，而在高浓度时（1 μmol/L）相对于对照组其碱性磷酸酯酶被明显抑制。对照药剂阿维菌素同样也表现出在低浓度时其碱性磷酸酯酶被激活，高浓度时被抑制的特性。经Spinosyn A、阿维菌素处理48 h之后，处理组的碱性磷酸酯酶比活力有了新的变化，所有处理组都表现出抑制作用，高浓度药剂比低浓度的抑制率要高些，方差分析的结果表明，所有处理组的比活力与对照组间差异显著。endprint

2.2 Spinosyn A对亚洲玉米螟酯酶同工酶的影响

图1、图2分别为Spinosyn A对亚洲玉米螟离体、活体酯酶同工酶的电泳图。由图1可知，在离体条件时Spinosyn A、阿维菌素与对照组相比，其电泳酶带都没有明显差别，说明在离体时酯酶同工酶的活性并不受到抑制。

由图2可知，处理24 h后，0.1 μmol/L的Spinosyn A处理组与对照组比，E6受到弱的抑制作用，其余酶带无明显差异；而0.1、1 μmol/L阿维菌素的E6酶带与对照组相比皆有明显抑制。在处理48 h的酶带图中，浓度为0.1 μmol/L的Spinosyn A组的E4、E5酶带都明显变弱，E6酶带也有减弱，1 μmol/L的Spinosyn A处理组与对照组无明显差异；而0.1、1 μmol/L阿维菌素处理组的E4、E5酶带都有强的减弱，1 μmol/L处理组的E6酶带完全消失，表明受到了强的抑制作用。

3 结论与讨论

磷酸酯酶广泛存在不同种类昆虫中，是昆虫体内的一种

主要的代谢解毒酶，它们参与中间代谢，对昆虫的生长发育起着重要作用。磷酸酯酶包括磷酸三酯水解酶和磷酸二酯水解酶，前者包括芳基酯水解酶和O-烷解水解酶，分别可使有机磷脱去芳基和O-烷基，而后者主要是使脱烷基的磷酸酯产生水解[12]。本研究的结果表明，在离体条件时，Spinosyn A对亚洲玉米螟幼虫体内的碱性磷酸酯酶并无抑制作用；但是在活体条件时，处理24 h后就出现在低浓度（0.1 μmol/L）时激活碱性磷酸酯酶的活性，而在高浓度时（1 μmol/L）抑制其活性，在处理48 h后则2种浓度下都表现出明显的抑制作用，这说明虽然Spinosyn A对亚洲玉米螟幼虫体内的碱性磷酸酯酶没有直接作用，但是它能通过间接的途径影响碱性磷酸酯酶的活性，最终表现出对碱性磷酸酯酶的抑制作用，这大概也是其在昆虫体内降解缓慢的原因之一。同时，在活体条件下Spinosyn A 对亚洲玉米螟幼虫体内的碱性磷酸酯酶的抑制与笔者所在课题组前期研究结果[8]是一致的，可能是多杀菌素对辛硫磷增效的原因之一。至于Spinosyn A在活体条件下是通过何种方式抑制碱性磷酸酯酶的活性有待于进一步研究。

亚洲玉米螟的酯酶同工酶电泳酶带结果表明，在离体时Spinosyn A并不影响酯酶同工酶；在活体时，E6受到一定程度的抑制。阿维菌素也同样对E6酶带有抑制作用，表明这2种大环内酯化合物都能抑该酶的活性。至于这个酶带具体是什么酶、有什么特点有待于进一步研究。

参考文献：

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