养猪废水中重金属-抗生素双抗菌的筛选

谢丽金，郭海珊，谢秀祯

（海南师范大学生命科学学院，海南海口571158）

长期以来，某些抗生素和重金属被添加于动物饲料已非常普遍.在黄浦江、海河、北江等水域都被检出常见兽用抗生素和抗生素抗性基因的普遍存在.这些流域的抗生素污染以磺胺类和四环素为主，而磺胺类和四环素类为养殖业常用抗生素，这些河周边刚好密集着大量的禽畜养殖场[1-3].在长期使用猪粪的作物中检测出铜、锌、砷均比未使用大型养猪场猪粪的含量高（P＜0.05），也有研究在施有机猪粪肥的土壤中也检测出土霉素和金霉素[4-5].如果土壤被污染后，大量的重金属和抗生素会随着食物链和食物网进入生物有机体，损害机体健康[6]，而对环境敏感的微生物可通过环境选择驯化形成重金属和抗生素协同抗性的双重抗性细菌.有研究从在渔业养殖场中分离到的假单胞菌属细菌有双重抗性，在广东某大型养猪场也筛选出多个双抗菌株[6-8]，当这些携带抗重金属和抗抗生素基因的双抗细菌在环境中进行传播、扩散，对公共健康和食品、饮用水安全等生态环境安全构成威胁[9-11].

海南现代特色农业既要求规模化大型化又要避免规模化所造成的环境污染.目前对养殖业废水中有机污染物及其处理比较重视，而对新的抗生素污染和重金属污染还没有引起足够的重视.但是许多微生物对重金属和抗生素具有抗性和富集能力，所以在重金属污染的土壤修复中微生物成为一种具有较好前景的修复工具[12-13].因此，本论文通过采集海南大型规模化养猪场养殖废水进行重金属和抗生素双抗实验，以期筛选出同时抗抗生素和抗重金属的双抗菌株，为以后研究抗性基因作用机理提供基础.

1 材料与方法

1.1 实验材料

养猪废水样品采自海南省海口市三江镇某大型养猪厂沉淀池，养猪废水内含有大量的固体粪便颗粒悬浮物、尿和清洗水.

1.2 培养基配制

1）基础培养基：牛肉膏3g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、琼脂15 g蒸馏水1000 mL pH7.0～7.2，灭菌（121 ℃，20 min）后倒平板备用.

2）试验培养基：以养殖废水代替基础培养基中的蒸馏水，灭菌（121℃，20 min）后倒平板备用，用于筛选养猪废水中的部分细菌.

3）抗性试验培养基：试验培养基冷却到60 ℃后加入CuCl2、NaAsO2、ZnSO4·7H2O 溶液，终浓度分别为：0.5mmol/L、2mmol/L 、1mmol/L；或加入盐酸四环素、磺胺二甲嘧啶、红霉素、杆菌肽锌溶液，终浓度分别为：10 μg/mL、280 μg/mL、50 μg/mL、32 μg/mL.将4种抗生素3种重金属，两两混匀，共12组，重金属和抗生素的交叉组合见表1.

表1 重金属和抗生素的交叉组合Tab.1 Cross combination of heavy metals and antibiotics

1.3 试验方法

1.3.1 养猪废水中优势菌的筛选

取10mL 过滤好的养猪废水样品，10 倍倍比梯度稀释后，将10-4和10-5稀释度的水样涂布在养猪废水配制的选择培养基上，每个稀释度做3 个重复.37 ℃培养1～2 d后观察.对具有明显特征的菌落划线培养，直至得到单一菌落，对菌株进行编号并记录菌落特征，以斜面培养基保存该优势菌，用于后续抗性实验.将分离纯化后得到的单菌落制片后用革兰氏染色液染色后用100×显微镜镜检，拍照并描述菌株特征.

1.3.2 菌株交叉抗性实验

将4 种抗生素3 种重金属，两两混匀，共12 组，重金属和抗生素的交叉组合见表1.在试验培养基冷却至60 ℃时，加入试验培养基中，摇匀后倒板.将筛选后以斜面培养基保存的菌株挑菌后重悬，菌液分别涂布在不同双抗板上，培养1～2 d，观察菌株的生长情况，筛选出双抗菌株，记录抗性结果.

2 结果与分析

2.1 养猪废水中优势菌的筛选结果

用养猪废水选择试验培养基分离出优势菌共有10种，菌落特征见表2.对这10株菌进行革兰氏染色后，在100×生物显微镜下观察到镜检图片如图1 所示.根据图1观察分析可知，分离得到的这10株优势菌均为细菌，其中6 株为革兰氏阴性菌，4 株为革兰氏阳性菌；4株为球状菌，6株为杆状菌.颜色呈现白色、黄色和橙红色.

2.2 交叉抗性菌株的筛选结果

由表3可见，10株优势菌中，除了10#菌株，其他9种菌株均有不同的重金属和抗生素交叉抗性.7#菌株能在11种交叉抗性板上生长，是交叉抗性最多的菌；1#、3#、4#、5#、8#、9#菌株有3种及以上的交叉抗性；2#和6#菌株仅具有1种交叉抗性.抗盐酸四环素的菌株有7 种：1#、3#、4#、5#、7#、8#、9#；抗磺胺二甲嘧啶的菌株有5种：1#、3#、7#、8#、9#；抗红霉素的菌株有3 种：3#、7#、9#；抗杆菌肽锌的菌株有9 种：1#-9#.抗NaAsO2的菌株有6种：1#、2#、4#、5#、7#、8#；抗CuCl2和ZnSO4·7H2O 的菌株一样，都是7 种：1#、3#、4#、5#、7#、8#、9#.

表2 养猪废水中优势菌菌落特征Tab.2 Colonial morphology of dominant bacteria in swine farm effluent

10株养殖废水优势菌中大多数菌株对盐酸四环素、磺胺二甲嘧啶、杆菌肽锌、NaAsO2、CuCl2、ZnSO4·7H2O产生抗性.不同菌株对抗生素和重金属表现出不同的抗性.筛选到的10 种优势菌中，G-菌占60%，这与王晓涛等[14]研究临床分离的抗生素抗性菌革兰氏染色结果相似，G-菌比G+菌比例高.在抗性细菌中，G-菌比例偏高的原因可能跟细胞的结构有关，G-菌比G+菌具有更广泛的抗性，抵抗多种重金属和抗生素交叉.G-菌的细胞壁上有许多脂多糖，脂多糖跟细胞的免疫反应有关，当外界有抗生素或重金属等胁迫时，菌群中G-菌被选择所占比例变多.由此可见，采样的海口市郊某养殖场已经长期存在不合理的滥用抗生素和重金属.

图1 10株优势菌的镜检照片（×100倍）Fig.1 Photomicrography of 10 dominant strains(×100)

表3 养猪废水中优势菌的交叉抗性Tab.3 Cross-resistance of dominants bacteria in swine farm effluent

3 结论

从养猪场废水中筛选得到10种优势菌株，这10株菌株对该养猪废水环境适应，G-菌占菌群的60%，具有较强的适应性和抵抗性.不同菌株表现出对不同抗生素和重金属的交叉抗性.其中7#菌株能在11种抗生素和重金属的交叉组合污染下正常生长，是交叉抗性最强的菌；10 株养猪废水优势菌中大多数菌株对盐酸四环素、磺胺二甲嘧啶、杆菌肽锌、Na⁃AsO2、CuCl2、ZnSO4·7H2O产生抗性，这些都是养猪饲料中最常用的添加剂，而相对少用的红霉素，其抗性菌也较少.说明微生物长期处于这些抗生素和重金属环境胁迫下已经产生了适应和微进化，也反映出养猪业滥用抗生素和重金属所带来的严重生态影响，必须引起人们的高度重视.

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