气肿疽梭菌PCR检测方法的建立

云巾宴　任春宇　车达　段雪岩　司唯　金鑫

摘要：为建立气肿疽梭菌（Clostridium chauvoei）的快速检测方法，根据GenBank中气肿疽梭菌细胞毒素CctA基因序列（登录号：JQ692583.1）设计了1对引物，以气肿疽梭菌标准株C54-1全基因组DNA为模板，建立了牛气肿疽梭菌的PCR检测方法，并进行了特异性、敏感性试验。结果表明，建立的气肿疽梭菌PCR检测方法扩增出的片段大小为501 bp，与GenBank上气肿疽梭菌的同源性达99.4%，且该方法与D型产气荚膜梭菌、E型产气荚膜梭菌、腐败梭菌和巴氏杆菌等病原体无交叉反应，最低检测浓度为12.30 fg/μL。结果表明，建立的PCR检测方法具有特异、敏感、高效等优点，与其他诊断方法相比更适用于气肿疽梭菌的诊断。

关键词：气肿疽梭菌；细胞毒素CctA；PCR诊断

中图分类号： S858.23 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2015）10-0053-03

气肿疽别称黑腿病，是由气肿疽梭菌（Clostridium chauvoei）引起的以皮下组织和肌肉丰满部位发生气性、炎性肿胀，按压之有捻发音为特征的急性、热性和败血性传染病[1]。病牛是本病的主要传染源，但并不直接传染给健康牛，而是随污染的土壤经饲料或饮水间接进入消化道而感染[2]。其芽孢能在土壤中长期生存，成为持久的传染源。本病一年四季均可发生，尤以炎热干旱的夏季容易发生，严冬则较为少见；呈地方性流行，低温高湿、低湿山谷或低洼地区更易发生[3]。

由于气肿疽梭菌的生长速度和其他梭状芽孢杆菌相比较为缓慢[4-5]，因其与其他梭状芽孢杆菌易发生交叉感染，所以很难从病原学和免疫学的角度对其病原体进行准确检测[6]；因此建立快速高效的检测方法显得尤为重要。近年来，随着生物技术的不断发展，逐步建立了一些新的血清学诊断方法和分子生物学诊断方法。本试验根据气肿疽梭菌细胞毒素CctA基因设计了1对特异性引物，旨在建立灵敏、准确的针对气肿疽梭菌的PCR检测方法，对已发生气肿疽病的牧场其他个体进行快速、高效的诊断，并广泛应用于临床实践。

1 材料与方法

1.1 试验样本及试剂

试验样本为气肿疽梭菌C54-1标准株；Ex Taq DNA 聚合酶、DNTP、pMD 18-T Simple vector均购自大连宝生物工程有限公司；NI-DL3000 DNA marker购自Newbio industry公司；凝胶回收试剂盒、质粒少量提取试剂盒购自美国Omega生物技术公司；D型产气荚膜梭菌、E型产气荚膜梭菌、腐败梭菌和巴氏杆菌均由延边大学预防兽医学实验室保存。

1.2 引物的设计与合成

根据GenBank上气肿疽梭菌细胞毒素CctA基因序列（登录号：JQ692583.1），用Primer Premier 5.0设计了1对引物P1（5′-CGGGATCCGGTGGGTATTATCAAGC-3′）、P2（5′-CCCTCGAGAGTTCCTTTTGGTGC-3′），由北京新产业公司合成。

1.3 基因组DNA的提取

采用酚-氯仿抽提法提取气肿疽梭菌菌体核酸DNA。

1.4 PCR反应体系及条件

PCR在25 μL反应体系中进行，双蒸水16.25 μL、10×Ex Taq buffer 2.50 μL、DNA模板 2.00 μL、dNTP 2.00 μL和P1、P2各1.00 μL、Eq Taq 0.25 μL，共计25 μL。PCR扩增程序：95 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，48.8 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，共30个循环；72 ℃ 10 min；4 ℃保存。

1.5 PCR产物的回收、克隆及测序

PCR产物50 μL进行琼脂糖凝胶电泳，用凝胶回收试剂盒回收目的条带；将回收产物与pMD 18-T simple vector进行连接，再转化进DH-5α大肠杆菌感受态细胞内，继而接种于含有氨苄抗性的LB固体培养基上，经37 ℃恒温培养12～16 h，挑取单个菌落于含有氨苄抗性的液体培养基中增菌培养，并提取质粒，经PCR和酶切鉴定后将质粒送往上海立菲生物技术有限公司测序。将测序结果与GenBank中气肿疽梭菌ATCC 10092菌株CctA基因进行同源性比较。

1.6 特异性试验

将D型产气荚膜梭菌、E型产气荚膜梭菌、腐败梭菌、巴氏杆菌的DNA按照气肿疽梭菌的DNA浓度稀释，用本研究建立的方法进行PCR扩增，并设阴性对照。

1.7 敏感性试验

提取气肿疽梭菌菌体DNA，测其D260 nm值，将DNA模板按1 ∶ 10比例连续稀释后进行PCR扩增，以此来确定本PCR方法的敏感性。

2 结果与分析

2.1 气肿疽梭菌CctA基因目的片段的PCR扩增

以气肿疽梭菌菌体DNA为模板，经PCR扩增出了大小为501 bp的目的片段（图1）。

2.2 目的基因的序列分析

将测序得到的结果与GenBank中气肿疽梭菌ATCC 10092菌株CctA基因序列（JQ692583.1）进行同源性比较，结果显示，核苷酸序列同源性达99.4%，共存在3处突变（图2），表明该引物适用于气肿疽梭菌的检测。

2.3 特异性试验

分别以气肿疽梭菌、D型产气荚膜梭菌、E型产气荚膜梭菌、腐败梭菌和巴氏杆菌的基因组DNA为模板，按照“1.4”节所述的扩增体系和反应条件进行PCR扩增，并以灭菌去离子水作阴性对照，后经琼脂糖凝胶电泳检测结果。结果显示，只有气肿疽梭菌扩增出目的条带，而其他均未出现目的条带，表明本试验建立的PCR检测方法具有较好的特异性（图3）。

2.4 敏感性试验

取气肿疽梭菌菌体DNA标准品，按1 ∶ 10倍比稀释后，用上述PCR方法进行检测，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳观察，结果表明，该PCR最低检测量为12.30 fg/μL（图4）。

3 讨论

气肿疽梭菌是引起气肿疽的病原体，常随污染的土壤经饲料或饮水间接进入消化道而感染[2]，也可经皮肤伤口或通过吸血昆虫叮咬进行传播[7]。该菌的芽孢潜伏期长、存活能力力强，能在土壤中长期生存，可成为持久传染源，故很难从根本上预防和控制本病的发生及流行，这些特性严重制约了

畜牧业的发展。而随着其易感群体的逐渐扩大，气肿疽梭菌也越来越多地威胁到了人类的安全。

目前常用的检测手段存在一定的弊端，病原学检查和免疫学试验都很容易与梭菌属的其他细菌发生干扰，并不能达到良好的效果。与常规检测方法相比，分子生物学方法更有优势，可准确检测低含量的病原菌。

本试验以牛气肿疽梭菌细胞毒素A（CctA）基因为基础建立的PCR检测方法，所获得的序列与GenBank（登录号JQ692583.1）上公布的序列同源性为99.4%，与产气荚膜梭菌、腐败梭菌、巴氏杆菌等病原体无交叉反应，证明其具有很好的特异性；最少可检测到12.30 fg/μL的DNA，证明其具有较好的敏感性；说明本试验建立的检测方法可广泛应用于对临床样本进行快速、高效的诊断，与其他诊断方法相比更适用于气肿疽梭菌的诊断。

参考文献：

[1]王正兴. 山区牛气肿疽诊断与防制[J]. 上海畜牧兽医通讯，2011（2）：107.

[2]郭洪友，郑 聃. 牛气肿疽病的诊治[J]. 现代农业科技，2010（7）：367，369.

[3]陆安法，徐官红，简廷安，等. 牛气肿疽的防制[J]. 动物医学进展，2003，24（6）：131-131.

[4]白 实，郭宇鹏，李艳华. 敦化地区黄牛气肿疽的防治与诊断[J]. 吉林畜牧兽医，2007，28（6）：38-39.

[5]Kuhnert P，Krampe M，Capaul S E，et al. Identification of Clostridium chauvoei in cultures and clinical material from blackleg using PCR[J]. Veterinary Microbiology，1997，57（2/3）：291-298.

[6]Halm A，Wagner M，Kfer J，et al. Novel real-time PCR assay for simultaneous detection and differentiation of Clostridium chauvoei and Clostridium septicum in clostridial myonecrosis[J]. Journal of Clinical Microbiology，2010，48（4）：1093-1098.

[7]孙 瑛，雷国云，于林洁. 牛气肿疽诊断与综合防治[J]. 中国畜禽种业，2008（17）：59-60.刘广卿，丁 芳，孙喜云，等. 速生高抗雄性杨的组织培养与快繁研究[J]. 江苏农业科学，2015，43（10）：55-56.