双单倍体马铃薯DM再生体系的构建

张超　杨永智　王舰

摘要：以双单倍体马铃薯（Solanum tuberosum）DM1-3-516-R44的无菌茎段、叶片作为材料，构建马铃薯离体再生体系。结果表明，茎段愈伤组织适宜的诱导培养基BI为MS+0.5 mg/L IAA+2.5 mg/L 6-BA，叶片愈伤组织适宜的诱导培养基BN为MS+1 mg/L NAA+0.5 mg/L 6-BA，愈伤的平均诱导率均达95%以上，甚至可以全部诱导愈伤形成；愈伤组织分化不定芽适宜的培养基BZ为MS+3 mg/L 6-BA+0.5 mg/L ZT，分化率也达到90%左右。

关键词：马铃薯；双单倍体；愈伤组织诱导；再生体系

中图分类号：S532.043 文献标志码：A 文章编号：1002-1302（2015）10-0050-03

马铃薯（Solanum tuberosum）是粮蔬两用的经济作物[1]，我国对马铃薯的需求量日益增加。马铃薯于17世纪传入我国，并迅速在我国西北地区大面积取代低产的粮食作物，成为当时西北地区最重要的粮食作物之一[2]。由于马铃薯通过营养体繁殖，繁殖数代后会出现高染病率，从而影响马铃薯的产量、品质[3]。近年来，随着细胞培养技术、基因组学的发展，马铃薯的品质得到极大提高。在我国，大多数学者以MS普通培养基为基本培养基，添加适量的植物激素，以马铃薯茎段、叶片、薯块等为材料得到再生植株[4]。由于不同品种马铃薯的基因型存在差异，导致马铃薯对植物激素的耐受性也不尽相同，因而各品种马铃薯的再生体系无法完全套用[5-11]。本试验所用材料为2011年测序成功的马铃薯品种，探究其再生体系，旨在为后续马铃薯基因表达、转基因研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

以2011年7月测序成功的双单倍体马铃薯DM1-3-516-R44无菌试管苗（简称DM）为材料，在MS基础培养基中扩繁，培养温度为（25±2） ℃，光照时间为14 h/d，白天采用日光灯补光。由于其长势较弱，故采用生长近1个月的无菌苗作为材料。所用植物激素IAA、NAA、2，4-D、6-BA、ZT[12]以及试剂均为生工生物工程（上海）股份有限公司产品。

1.2 方法

结合DM本身特性，利用植物分裂素IAA、NAA、2，4-D和植物生长素6-BA、ZT不同浓度配比来诱导愈伤组织形成、不定芽分化[9，13-17]。

1.2.1 茎段、叶片的愈伤组织诱导 选取生长30 d左右的DM无菌马铃薯试管苗，分别切下叶片、茎段，去除叶片边缘。切取长为0.5 mm左右的茎段，不可带生长点。分别将上述材料放入加有植物激素的MS培养基中，培养25～30 d。

为了得到更加合适的配比，设定植物分裂素与植物生长素配比从高到低为梯度，进一步确定诱导茎段、叶片愈伤组织合适的植物激素配比。

1.2.2 愈伤分化不定芽培养基的选择 将愈伤组织放入含有不同激素浓度配比的MS基础培养基中。目前，学者们大多利用6-BA、NAA、GA3作为诱导芽分化的培养基[6，11，13，18-19]。结合本材料的特性以及前期预试验结果，选用不同浓度6-BA、ZT、IAA配比来确定分化诱导不定芽的培养基[11，20]。

2 结果与分析

2.1 不同激素配比对马铃薯愈伤组织诱导效率的影响

在6-BA和IAA激素组合中，大多数茎段在培养25 d左右时均有愈伤产生，当6-BA浓度低于IAA时，部分愈伤容易生根；当6-BA浓度与IAA浓度相差过大时，容易产生色绒毛状的致密愈伤，且形成时间较长。在叶片中，大多数叶片出现发黄、死亡现象，有些会出现生根现象。所以由结果可知，IAA只适合茎段愈伤的形成（表1）。当6-BA浓度过高时，部分叶片发黄、死亡；当6-BA或NAA浓度过高时，可能会产生细根；当NAA与6-BA浓度相当时会产生愈伤。茎段则部分不会形成愈伤或者愈伤过于疏松，呈透明膨大状，因此可以推测NAA不适宜茎段的愈伤形成（表2）。表3中，6-BA与2，4-D大部分浓度配比会使茎段、叶片产生疏松愈伤并生根；部分配比会产生疏松、透明愈伤，即6-BA、2，4-D组合形成的愈伤不适于分化。植物分裂素IAA适合双单倍体马铃薯DM茎段愈伤组织的诱导，植物分裂素NAA更适于双单倍体马铃薯DM叶片愈伤组织的诱导。只利用IAA或NAA时，愈伤诱导率远低于添加6-BA的愈伤诱导率。添加高浓度6-BA时，茎段、叶片的诱导率也相对较低，甚至出现发黑、发黄的迹象。由表4、表5可知，茎段愈伤组织适宜的诱导培养基BI为MS+0.5 mg/L IAA+2.5 mg/L 6-BA，叶片愈伤组织适宜的诱导培养基BN为MS+1 mg/L NAA+0.5 mg/L 6-BA。

化均较好。当6-BA浓度高于4 mg/L时，会延长愈伤组织分化所需时间。表7结果表明，6-BA与ZT适宜的浓度配比，不仅减少了愈伤组织分化时间，而且同时可作用于叶片、茎段愈伤。由表6、表7可知，影响愈伤组织分化效率最重要的因素是植物生长素浓度。当6-BA浓度低于3 mg/L时，明显发现愈伤组织分化时间延长，且分化的苗长势较弱；当6-BA浓度高于5 mg/L时，愈伤组织逐渐发黄，无法形成健康的幼苗。因此比较适宜的愈伤组织分化不定芽培养基BZ为MS+3 mg/L 6-BA+0.5 mg/L ZT。

3 结论

由于各种植物的基因存在差异，因此植物对激素的耐受性也存在很大区别。本试验经过大量筛选，初步筛选出茎段愈伤组织适宜的诱导培养基BI为MS+IAA 0.5 mg/L+6-BA 2.5 mg/L，叶片愈伤组织适宜的诱导培养基BN为MS+1 mg/L NAA+0.5 mg/L 6-BA，愈伤组织分化不定芽适宜的培养基BZ为MS+3 mg/L 6-BA+0.5 mg/L ZT，这与前人研究结果[8-10，21]一致。

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