兰花种子萌发研究进展及对国兰杂交育种的启示

李风童　包建忠　孙叶　刘春贵　马辉　张甜　陈秀兰

摘要：综述了中国兰花育种概况以及兰花种子萌发研究现状，对共生萌发及非共生萌发技术在兰花种子萌发中的应用进行了总结，重点阐述了种子胚胎发育特点及发育阶段对种子非共生萌发的影响，指出了深入研究国兰种子胚胎发育特性的必要性，旨在为今后促进中国兰花育种提供参考。

关键词：兰花；种子萌发；胚胎发育；中国兰花育种

中图分类号： S682.310.36 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2015）10-0013-03

广义的兰花是整个兰科（Orchidaceae）植物的总称，是目前单子叶植物中最大的一个科，同时也是单子叶植物中最进化的一个科。兰花广泛分布于全世界各地，据统计约有800个属，30 000～35 000个种[1]。国兰特指中国境内兰属（Cymbidium Sw.）植物部分地生种，中国是兰属植物的分布中心，目前已记载有49种，其中19种为特有种[2]。中国兰作为中国的传统名花，因其株型典雅、花姿优美、幽香四溢，自古以来深受人们的喜爱，主要以春兰 [C. goeringii （Rchb. f.） Rchb. f.]、蕙兰（C. faberi Rolfe）、建兰 [C. ensifolium （L.） Sw.]、墨兰 [C. sinense （Jackson ex Andr.） Willd.]、寒兰（C. kanran Mak.）等地生兰为代表[3]。

兰花因其重要的观赏、经济及科研等价值，种子萌发机理一直是各国兰科植物学家所研究的热点之一，为部分濒危兰花的保育及重要观赏兰花的育种作出了重要贡献，但部分地生兰种子萌发机理仍然是当前研究的难点，国兰方面的相关研究基础更为薄弱。本研究综述了当前部分兰花种子发育方面的研究进展以及国兰杂交育种概况，重点阐述了可能影响兰花种子萌发的胚胎学机理，旨在为提高国兰种间杂交种子萌发率以及国兰杂交育种效率提供技术依据。

1 中国兰花杂交育种概况

中国兰花在我国有着悠久的栽培历史，在长期的野外采集和栽培中出现了许多优良的变异品种。近20年来，深受日本、韩国、台湾兰花市场的影响，国兰的采挖、种植、销售产业发展较快，选择育种成为当时国兰育种的重要手段，虽然也选育出许多优良的自然变异植株（品种），但却导致国兰自然资源掠夺性的采挖和珍贵种质资源外流[4]，积极有效开展国兰育种工作，推进国兰种质资源创新就显得迫在眉睫。吴汉珠等首次报道了中国兰应该综合采用生物技术、核技术、杂交育种等多种途径进行育种，并相继报道了49个杂交组合的种子萌发情况，其中包括了兰属内地生种与地生种之间的杂交，培育出新品种10多个[5]，这是我国兰花栽培历史上一个新的起点。近年来，基因克隆[6-7]、体细胞快繁[8-10]、辐射诱变[11-12]、同工酶分析[13]、分子标记[14-16]等技术手段已在国兰育种及种质资源评价中有所应用，为提高国兰育种效率提供了参考，但效果却极为有限，开展国兰种间以及品种间常规杂交育种仍然是国兰育种中使用最为普遍、最重要的一种方法。

目前，中国兰尤其是原生种，因为其优良的抗性、香味和观赏特性已作为重要亲本被广泛应用到大花蕙兰等洋兰的杂交育种中去[17-20]。近年来，虽然针对国兰种间杂交育种的报道逐渐增多，而国兰新品种的人工培育工作无论是从规模上，还是在研究进展方面，基本处于刚刚开始探索阶段，在种间远缘杂交方面更是缺乏系统研究。张志胜等开展了中国兰花墨兰和春兰、建兰和墨兰、建兰和寒兰等种间杂交研究，发现不同杂交组合杂交种子萌发率存在较大差异，但并未深入研究其原因[17]；徐晓薇等开展了寒兰和春兰、寒兰和墨兰种间杂交研究，发现杂交易成功，但未对杂交种子的萌发开展深入研究[2]；李枝林等曾开展蕙兰与墨兰的种间杂交，但因数量较少，只开展了2朵花的杂交，并未得到杂交种子[21]。相对于洋兰在品种改良方面取得的巨大成功，中国兰的杂交育种工作进展及商品化进程则相当缓慢，其中一个重要原因就是其杂交种子萌发难，杂种试管苗生产效率低[17]。国兰杂交种子尤其是远缘杂交种子培养比洋兰困难，种子萌发需时长，萌发率低。作为国兰育种的关键环节，种子的萌发直接关系到国兰杂交育种的效率和成败。因此，对国兰杂交尤其是远缘杂交种子发育特性以及萌发机理开展深入研究，建立高效萌发体系尤为必要。

2 兰花种子萌发研究现状

2.1 兰花种子的共生萌发

兰花种子极其微小，种皮内仅有1个发育不完全的胚，没有胚乳和子叶，只有脂滴和少量蛋白质，缺乏萌发过程中所需要的后备营养[22-24]，自然条件下萌发率极低。20 世纪初，法国的Bernard 和德国的Burgeff 就证实，只有感染了合适的真菌后，兰科植物的种子才能在自然生态条件下萌发生长，随着国内外学者的深入研究，逐渐确立了兰花种子与真菌菌根的共生体系[25]。目前，兰花菌根已成为菌根研究中很重要的组成部分，众多研究表明，兰花菌根在促进兰花种子萌发及幼苗生长方面具有重要的生态作用。一是兰花种子只有经过真菌菌丝穿过种皮之后，通过胚胎细胞消化菌丝的方式才能萌发，在萌发的早期阶段利用真菌分解原球茎中的贮存物，并向其提供有机和无机养分保证原球茎的生长发育[26-28]；二是虽然大部分兰花在成苗后可独立进行光合作用，不需要真菌提供碳源，但是兰花和真菌已形成共生体系，仍然会通过共生真菌吸收环境中的磷、磷、钾等营养元素及水分[29-31]。目前，国外对于兰花菌根研究较为深入，在真菌的分离、鉴定和筛选等方面也较为成熟，兰花种子共生萌发技术已经在许多兰科植物中有所应用，并取得较高的种子萌发率和成苗率[32-34]。国内对于兰花菌根研究则相对比较薄弱，主要集中在菌根真菌多样性分析[35-36]和真菌的分离和鉴定[37-38]，对于共生萌发的研究则较少。杨友联等采用从独蒜兰（Pleione bulbocodioides）分离的菌根真菌与其种子在燕麦培养基上共生萌发，发现不同菌根真菌种有的能明显促进种子萌发，有的则会引起原球茎死亡[39]。范黎等研究发现，开唇兰小菇（Mycena anoectochila）可与天麻（Gastrodia elata）种子共生，并显著促进其原球茎的生长[25]。虽然兰花种子共生萌发技术对于促使幼苗根系菌根化、提高幼苗成活率具有重要意义，对于部分野生兰花的保育具有重要价值，但兰花与其共生真菌之间的关系十分复杂，许多问题诸如对真菌的专一性、真菌的侵入机制、兰花与真菌共生系统调控、营养物质转运等的了解仍然远远不够，加之共生萌发技术的操作极为繁琐，致使其在生产上的应用十分有限，因此，非共生萌发技术在兰花繁殖及育种研究中仍然占有非常重要的地位。

2.2 兰花种子的非共生萌发

目前，国内外对于兰花种子非共生萌发的研究报道大多集中在对非共生培养体系中培养基配方进行筛选[20，40-42]、对种子进行预处理[43-45]等方面，用以提高种子的萌发率。但以上方法仅仅依靠改变种子萌发的外在环境，种子本身的发育特点是否直接影响种子萌发率还不得而知。许多研究发现，兰花未成熟种子的萌发率要显著高于成熟种子的萌发率。如杓兰属（Cypripedium）几个种的成熟种子萌发远比未成熟种子困难[46-47]。Deb 等认为纹瓣兰[Cymbidium aloifolium （L.） Sw.]授粉后果荚的发育阶段是其种子能否顺利萌发的关键因素，同时发现授粉后9 个月的未成熟种子萌发效果最好，而大于11 个月的种子萌发出现畸形[48]。徐晓薇等研究了果龄对寒兰杂交种子萌发的影响，发现杂交授粉后180～240 d 为寒兰种子的最佳采收时间，早于180 d，种子萌发欠佳；晚于240 d，种子萌发率显著下降[2]。以上研究均表明，兰花种子在不同发育阶段存在不同的萌发特性。有研究报道，兰花种子发育过程中，蛋白及多糖含量发生了变化，胚柄细胞起着重要的调节作用[49-51]。此外，兰花种子发育后期珠被细胞会发生角质化也会影响种子萌发，Yamazaki等对金兰（Cephalanthera falcata）人工授粉后50～120 d 的种子萌发及发育特性进行研究，发现授粉后70 d 的种子萌发率达到最高，时间越长萌发率越低，同时发现种子发育后期（授粉后90 d），包围胚胎的内珠被开始积聚木质素，并最终纤维化和角质化，有可能会导致种子的休眠[41]。Lee等也发现台湾杓兰（Cypripedium formosanum）种子发育后期（授粉后135 d）萌发率极低，内珠被同样检测到角质化物质，同时利用不同培养基配方和对种子进行预处理等方法检测种子萌发率，认为种子的采收时间更能影响种子的萌发率[52]。

3 对国兰杂交育种的启示

国兰种内及种间杂交结实较容易，普遍可得到杂交果实，但种子萌发困难，国内对于影响其萌发的机理研究报道较少，借鉴前人相关研究成果，我们得出如下设想：（1） 杂交种子发育是否正常？既然能结实说明可完成部分授粉受精，但是，因为种子极其微小，受精以后胚胎的发育是无法预知的，成熟种子的胚胎是否正常？正常种子比例是多少？种子活力如何？可开展深入研究。（2）如果胚胎发育异常，相关机理是什么？胚胎发育与其细胞超微结构变化、营养物质积累以及胚柄细胞的活动状态都有紧密的联系，具体哪个环节出现异常？还需要深入研究。（3）如果胚胎发育正常，是什么原因导致了种子萌发率低？可结合胚胎发育特性、检测珠被细胞角质化物质积累以及培养基配方的影响等方面进行探讨。国兰在我国有着悠久的栽培历史，而且蕴含浓厚的兰文化，5种国兰各具特色，如春兰株型典雅；蕙兰香气浓郁，抗逆性强；墨兰叶形漂亮，叶色变异丰富；建兰可多季开花且花色花型变异丰富；寒兰则株型修长，香味清醇。开展中国兰种内和种间远缘杂交育种具有非常重要的意义，如能明确影响其种子萌发的胚胎学机理，同时结合不同发育阶段杂交种子在不同培养基配方的非共生萌发情况，揭示胚胎发育特性与种子萌发的关系，上述研究工作不仅将有助于我们从细胞水平上为建立国兰杂交种子的高效萌发体系提供理论支持，而且可采取有效措施适时采收杂交种子、缩短国兰育种周期促进国兰种质资源创新，也可进一步丰富国兰生殖生物学资料，为国兰其他相关研究提供重要的理论依据。

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