超高效液相色谱法测定白芍中芍药苷的含量

任冬雪 成刚 李涛 王茜 路一平 赵海南(.北京中医药大学东方学院，

河北 廊坊 065001；2.北京燕山玉龙石化工程有限公司， 北京 102500）

0 引言

白芍为茅根科多年生草本芍药的干燥根。味苦酸，性凉；入肝、脾经，对胸腹胁肋疼痛，泻痢腹痛，自汗盗汗，阴虚发热，月经不调等症有较好治疗效果[1]。白芍的主要成分是芍药苷，然而芍药苷的药用开发目前还有很多工作要做，如改进分离、提取工艺，以获得更多的有效成分。本试验通过改变芍药苷前处理方法，简化实验步骤，并通过改变洗脱溶剂，尽可能多的除去杂质，以减小试验系统误差、增加实验的准确度、同样使样品得到更好的分离，并延长色谱柱使用寿命，为白芍提取物的含量测定提供简便可行的方法。

1 超高效液相色谱(UPLC）

超高效液相色谱(Ultra Performance Liquid Chromatography/UPLC)是分离科学中的一个全新类别，其原理与高效液相色谱法基本相同。UPLC借助于HPLC(高效液相色法)的理论及原理，涵盖了小颗粒填料、非常低系统体积及快速检测手段等全新技术，增加了分析的通量、灵敏度及色谱峰容量。目前，超高效液相色谱仪已经开始逐渐地投入液相实验中。主要应用于药物分析(如天然产物中复杂组分的分析）[2]、生化分析(如蛋白质、多肽、代谢组学等生化样品）、食品分析(如食品中农药残留的检测）[3]和环境分析(如水中微囊藻毒素的检测）[4]，此外，还用于化妆品中违禁品的检测。

超高效液相色谱仪尤其对中药研究领域的发展是一个极大的促进。中药的组分复杂，分离困难等问题都可以通过超高效液相色谱法逐渐解决。

2 实验部分

2.1 仪器与药品

实验仪器:万分之一电子天平；超高效液相色谱仪；Waters UPLC ；Waters T3。

实验药品:芍药苷对照品(中国药品生物制品检定所提供）；甲醇(分析纯）；甲醇(色谱纯）。

2.2 实验方法

(1）色谱条件与系统适用性试验

实验是用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；以甲醇-异丙醇-柠檬酸水溶液(5mol/L）(18∶2∶80）为流动相；检测波长240nm；理论板数按芍药苷峰计算应不低于4000。配制流动相用甲醇及异丙醇采用色谱纯，其余试药及溶剂采用分析纯。

(2）对照品溶液的制备

精密称定芍药苷对照品10mg，置50ml容量瓶中，加80%甲醇溶解，定容，摇匀，精密量取5ml于50ml的容量瓶中，加80%甲醇制成每1ml含芍药苷20μg的溶液，摇匀即得。

(3）供试品溶液的制备

取本品 0.08g(天平:万分之一），精密称定于25ml容量瓶中，加入80%甲醇适量，超声处理使充分溶散，用80%甲醇稀释至刻度，摇匀，精密吸取2ml至25ml量瓶中，加80%甲醇稀释至刻度，摇匀，过0.22um滤膜，即得。

(4）测定法

精密吸取对照品溶液与供试品溶液各2μL，依次注入超高效液相色谱仪，测定，根据色谱图的积分值按公式进行计算，即得。

3 实验结果与讨论

3.1 线性和范围

以峰面积为纵坐标，以对照品进样浓度(mg/ml）为横坐标，绘制标准曲线，得线性方程相关系数r，r≥0.999。

3.2 重复性

取同一批号样品，平行制备6份供试品溶液，并按其色谱条件进行测定，计算6份样品测定结果的RSD值。经测定白芍提取物中芍药苷的平均含量为75.4mg/g，RSD%=0.61%，重复性良好。

3.3 稳定性

制备对照品溶液，进行对照品溶液稳定性实验。分别在0、2、4、8、16、24小时进样测定，计算峰面积的RSD 值。经计算芍药苷对照品溶液在24小时内进样峰面积的RSD分别为1.8%，24小时内稳定。

供试品溶液稳定性实验方法同上，经计算芍药苷供试品溶液在24小时内进样峰面积的RSD分别为1.2%，24小时内稳定。

3.4 回收率

采用加入50%量的对照品，以同一批6份样品测定结果进行评价。

取同一批白芍浸膏约0.04g，精密称定，再分别精密加入浓度为32.02mg/ml的对照品溶液10ml，相当于加入芍药苷对照品3.202mg。按照供试品制备方法制备供试品溶液，并进行测定。结果如下表1。

表1 芍药苷加样回收率结果

结论:平均回收率为98.2%，RSD为1.4%，准确度良好。

3.5 耐用性

按照上述实验方法和条件，分别用2种色谱柱(色谱柱①Waters T3；色谱柱② Waters BEHC18）对一批样品芍药苷含量进行测定，观察不同色谱柱对含量测定的影响。经观察两种色谱柱测得芍药苷含量的相对平均偏差为0.53%，耐用性良好。

取3批样品，按同样方法及色谱条件进行检测，结果见表2。结果显示样品测定中两份平行相对样品的相对平均偏差均小于2.0，耐用性良好。

表2 耐用性样品测定结果

4 结语

本文通过超高效液相色谱法对白芍浸膏芍药苷含量测定方法进行验证，包括线性与范围、精密度、重复性、溶液稳定性、准确性(即回收率）、耐用性及样品含量测定。实验结果显示利用UPLC方法测定芍药苷的含量有很多优点，如可以提高实验效率，简化实验步骤，减小实验系统误差、增加实验的准确度，使样品得到更好的分离，提高分离度，为白芍提取物含量测定提供了简便可行的方法。

[1]黄兆胜，中药学[M].人民卫生出版社,2011,452.

[2]王芸.复杂天然产物特征组分HPLC筛选方法的研究[M].华东理工大学,2011.

[3]Chen L.G.,Lan D.,Jin H.Y.et al.The determination of organochlorine pesticides based on dymanic microwave-assisted extraction coupled with on-line solid-phase extraction of highperformance liquid chromatography[J].Analytic Chimica Acta,2007,589:239-246.

[4]张立将，尹立红，等.水中微囊藻毒素高效液相色谱检测与前处理条件优化[J].东南大学学报(自然科学版),2005,3:446-451.