处理甜菜加工副产物微生物燃料电池阳极生物膜群落多样性研究

梅晓雪，吴 迪，王明波

(1.哈尔滨师范大学生命科学与技术学院，黑龙江哈尔滨150025;2.东北林业大学生命科学学院，黑龙江哈尔滨150040)

近年来，由于化石能源的减少使得人们将目光转向可再生能源。目前主要的可再生能源是从玉米、谷物以及甘蔗等木质纤维原料中获得，这些原料的使用可降低生产成本［1－3］。木质纤维原料的主要成分包括纤维素、半纤维素和木质素。而甜菜渣作为甜菜糖加工过程中的剩余物，由于其较高的碳水化合物和低木质素含量，也是一种很有前景的木质纤维原料［4］。然而目前甜菜渣由于水分大，不便运输和贮存，一部分作为反刍动物的饲料被利用。少量甜菜渣制粒后出口，而其他大部分鲜渣就地积压腐败，造成资源浪费和环境污染［5］。目前越来越多的研究关注甜菜渣的新用途，如利用甜菜渣发酵生产燃料乙醇［6］。此外，甜菜渣再利用产能技术的研究也包括厌氧产氢、产甲烷［7］等。

微生物燃料电池(Microbial fuel cell，MFC)作为一种新型的能源回收技术成为研究的热点。它以阳极上微生物作为催化剂，能够直接将储存在有机物中的化学能转化成电能［8－9］。微生物燃料电池实现了去除废水中的污染物的同时同步产电，因此这项装置降低了废水处理的运行成本［10］。此外，MFC能够将多种有机物转化成电能，如葡萄糖、乙酸［11］、蛋白质［12］以及秸秆［13］等。简单的小分子有机物比起复合物较容易产电［14］。而不同的底物不仅能够影响MFC的启动时间、功率密度以及库伦效率，还能够影响阳极微生物的群落构成［15］。而阳极上附着的微生物对电子传递有着重要的影响，因此，分析阳极微生物群落结构和多样性对研究微生物燃料电池产电性能有重要的意义。

近年来，454 GS-FLX焦磷酸测序技术的出现，很大程度上提高了微生物群落分析技术的水平。由于传统的分析技术有限的测序量，如变性梯度凝胶电泳(DGGE)等，极大地低估了微生物群落真实的多样性［16］。这些结果意味着人们对产电微生物群落的多样性和结构的认识是不全面的。而454焦磷酸测序技术具有更廉价、通量大等优点，可以高效准确地反映MFC系统中的微生物群落结构［17］。笔者以不同处理下的甜菜渣作为底物，以MFC为研究装置，考察其产电性能，并通过454焦磷酸测序技术分析不同处理MFC中形成阳极群落结构差异，探讨其运行的可行性、稳定性，为甜菜渣处理及回收利用提供新型技术支持。

1 材料与方法

1.1 试验装置 试验在单室无膜的320 ml玻璃瓶反应器中进行。碳纸作为阳极悬挂在瓶子中央，阴极为碳布阴极，在溶液一侧涂有0.5 mg/cm2的Pt(20 wt%Pt/C)和Nafion(5%)作为催化剂。在阴极与空气接触的一侧涂有PTFE，作用是允许空气通过阴极而防止溶液渗出。阳极与阴极之间通过1 000 Ω外电阻相连。电压通过与电脑相连的数据采集系统每隔30 min进行采集一次并记录。所有反应器均在30℃的恒温箱里进行。

1.2 材料和培养基 取自松花江沉积物上清液作为微生物燃料电池(MFC)接种物启动并运行反应器。阳极室的电解液 为 50mmol/L PBSbuffer:Na2HPO4， 4.58g/L;NaH2PO4·H2O，2.45 g/L;KCl，0.13 g/L;微量元素和维生素。加入底物后pH调整为7.0。

甜菜渣由黑龙江省某榨糖厂提供。分别将甜菜渣进行酸碱预处理并与未处理的甜菜渣进行比较。酸处理为固液比1∶10 g/ml的条件下，用1.7%的硫酸通过高压灭菌锅在120℃处理120 min。酸解后保留上清液，离心弃去残渣。再用Ca(OH)2将水解液pH调到中性，再次离心除去产生沉淀。碱处理是在固液比为1∶10 g/ml的条件下，用2%的氢氧化钠在100℃处理1 h后，保留固体部分，残渣水洗至中性［18］。未处理和碱处理的底物浓度为1 g/L，酸处理的底物浓度为(697±50)mg COD/L(反应器初始浓度)。

1.3 DNA提取 反应器运行60 d后，从微生物燃料电池的阳极生物膜取样进行群落分析。阳极碳纸被剪下，通过Powersoil DNA 抽提试剂盒(MoBio Laboratories，Inc.，Carlsbad，CA)提取样本中总DNA。具体方法请参照手册说明。

1.4 阳极微生物群落454焦磷酸测序 提取出来的总DNA使用通用引物8F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和533R(5'-TTACCGCGGCTGCTGGCAC-3')对3个样品的细菌16S rRNA基因V1～V3区进行扩增。通用引物上还包括454接头A和B、条码以及连接序列。扩增的目的片段平均长度为455 bp。所有的扩增混合物通过Roche 454 GS－FLX程序装置进行焦磷酸测序。所获得的序列在不同系统发育组，例如纲和属水平进行分类，并且按着占每个样品总序列数的百分比表示相对丰度。测序数据的热图通过R heatmap.2(gplots package)软件绘制。统计学分析如Chao1和Shannon指数在核酸相似度为97%通过Mothur软件生成。稀释度曲线基于核酸相似度为97%和95%通过Mothur、plot-rarefaction软件生成，利用Excel软件绘制。

2 结果与分析

2.1 不同处理下MFC产电性能比较 在单室空气阴极反应器中，以未处理的甜菜作为底物MFC在2 d产电最先达到最大，电压为530.1 mV;而碱处理和酸处理的甜菜作为底物时，启动周期较长，电压达到最大分别为566.2 mV和472.5 mV(图1)。经碱处理后的甜菜作为底物运行的反应器产生电压略高于酸处理和未处理对照，此外，在最高电压时持续的时间也最长。不同底物下MFC电压的变化均经历了增长期、稳定期和下降期3个时期。此外，未处理和碱处理的甜菜渣MFC的最大功率密度分别为(369±23)mW/m2和(351±20)mW/m2，均高于酸处理的最大功率密度(244±4)mW/m2。结果说明甜菜渣的不同处理方式对MFC电能的输出有明显的影响。

2.2 不同处理阳极群落丰富度和多样性分析 该研究对3种处理甜菜渣MFC阳极生物膜群落进行焦磷酸测序分析。未处理、碱处理和酸处理的MFC微生物群落测得序列读取数分别为5 370、6 496和5 182，平均序列长度为455 bp。在核酸相似度为97%时，获得的操作分类单元(OTUs，operational taxonomic units)数量分别为965(未处理)、593(碱处理)和999(酸处理)。随着序列数量的增加，新的细菌种系型不断增加(图2)。此外，来自未处理、碱处理和酸处理3个样品阳极群落，经Chao1指数估计的OTU总数分别为2 228、1 193和2 331。结果显示，酸处理的丰富度高于碱处理和未处理。Shannon多样性指数不仅能够表征群落物种的丰富度，还能够提供物种分布均匀性的信息［19］。3个样品中酸处理的Shannon多样性指数最高为5.30，未处理次之Shannon指数为4.88，而碱处理的多样性最低 Shannon指数仅为3.66。

2.3 不同处理MFC群落结构差异性分析 基于核酸相似度为97%的操作分类单元(OTU，operational taxonomic units)，聚类分析被构建用于辨别3个微生物群落结构差异(图3)。结果可知，3个样品被聚为2组，未处理和碱处理被聚为一组，酸处理单独成为一组。图3清晰地呈现酸处理组与未处理和碱处理组在群落结构上的差异，尽管在反应器启动时接入了相同的接种物。结果说明，3个样品中MFC阳极生物膜群落的形成具有选择性，不同处理的甜菜渣对微生物群落结构具有显著性影响。

2.4 不同处理MFC群落系统发育分类 甜菜残渣3种处理样品作为底物，阳极微生物群落在门水平的多样性分布如图4所示。3个样品的细菌主要分布在14个门。其中变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和厚壁菌门(Firmicutes)为优势门。变形菌门在碱处理的MFC阳极生物膜群落中丰度达到最大，为72.7%。而拟杆菌门在未处理样品的阳极生物膜上丰度最高为33.5%。

3种残渣处理在纲分类水平上呈现了较强的多样性分布，共有26个纲。δ-Proteobacteria、β-Proteobacteria和Bacteroidia为优势纲(图5)。其中δ-Proteobacteria在这3个样品中所占比例均为最高。知名的产电属Geobacter和Shewanella属于这个纲。碱处理的MFC阳极生物膜群落在纲的水平δ-Proteobacteria占67.1%，而未处理和酸处理中δ-Proteobacteria相对丰度略低于碱处理，分别为30.0%和32.5%。

不同底物下，阳极上的微生物群落结构与电流的产生密切相关。3个测序样品进行比对，在生物分类学属的水平进行分类，所有序列共属于111个属(图6)。优势属为产电属Geobacter，在未处理、碱处理和酸处理中所占比例分别为28.7%、66.3%和30.2%。此外，在未处理和碱处理的样品中检测到Bacteroides的丰度分别为2.7%和1.4%，已证实Bacteroides为纤维素分解菌，能降解纤维素产生乙酸［20］。Geobacter不能直接利用纤维素，但是可以利用Bacteroides产生的乙酸作为电子供体产电。而在酸处理的MFC阳极生物膜上，产电属Klebsiella的丰度为5.9%。这个属可以利用甜菜残渣酸处理后产生的糖类物质产电［21］。此外，酸处理的MFC阳极生物膜中还存在许多的发酵菌属，如Petrimonas［22］和Spirochaeta［23］等。这是由于甜菜渣酸处理后可溶性糖的存在易于发酵菌的富集，而较多的发酵菌可能导致与产电菌之间对电子供体的竞争，进而导致产生相对较低的电压。

3 结论与讨论

木素纤维素原料酸处理的产物主要是可溶性糖和少量的小分子有机酸，碱处理的产物主要是纤维素［18］。可溶性糖作为发酵底物比起非发酵底物如乙酸和丁酸能够形成更加丰富的微生物群落。由于葡萄糖等可溶性糖所固有的发酵特性使得多种细菌可以代谢葡萄糖产生可溶性发酵终产物如乙酸、丙酸和丁酸［15］。在酸处理的MFC中所测得的序列属于87个属。在未处理的MFC中由于残留少量的糖，所以测得属的数量(67个)略高于碱处理的MFC(49个)。虽然在酸处理的MFC阳极生物膜群落多样性较为丰富，然而较多存在的是发酵菌，影响了产电菌对电子供体的利用，因而导致较低的电量输出。而在纤维素为主要底物的碱处理MFC中较少存在发酵菌，该反应器最大电压也最高。

MFC中不同的产电菌存在不同的电子供体和胞外电子传递途径。例如，Desulfuromonas acetoxidans［24］和 Geothrix fermentans［25］能够代谢多种有机酸如乙酸、丙酸或者乳酸，并能够利用电极作为电子受体直接产电。而Klebsiella pneumoniae［21］和 Rhodoferax ferrireducens［26］被证实可以利用葡萄糖作为电子供体直接将电子传递到电极上。在该研究中，3种底物的MFC阳极生物膜群落中，均以δ-Proteobacteria纲占优势。在MFC中大多数的产电菌，如Geobacter和Shewanella均属于这个纲。在属的水平，产电菌属Geobacter在3种底物的阳极生物膜上均为优势属。此外，在酸处理中还存在少量的产电菌属Klebsiella，这是因为甜菜渣经酸处理以后溶液中主要为可溶性糖，Klebsiella能够直接利用葡萄糖等产电。

不同的底物类型导致MFC阳极生物膜上形成不同的菌群互作类型。而在酸处理的MFC中，发酵属Petrimonas［22］和Spirochaeta［23］等能够代谢可溶性糖产生小分子有机酸如乙酸。在未处理和碱处理的MFC中，Bacteroides属能够利用植物多糖如纤维素或者半纤维素产生乙酸等小分子有机酸。MFC中存在的乙酸可以作为Geobacter的电子供体进一步被用于产电。该研究说明，甜菜渣不同处理后产生的有机物能够在微生物燃料电池中产生电能，也证实微生物之间存在互养关系，即在产电菌和纤维素降解菌之间或者产电菌和发酵菌之间，而这种互养关系也有利于底物的降解和电能的产生。

454焦磷酸测序结果表明，酸预处理的甜菜渣阳极生物多样性高于未处理和碱处理。然而酸处理的阳极群落中以发酵菌居多导致产电较低。聚类分析将3个样品分为2组，未处理和碱处理的样品聚为一类，而酸处理的阳极群落与前两者差异较大，单独分为一类。阳极微生物之间的互养关系有利于MFC产电，纤维素降解菌或者产酸发酵菌能够产生小分子有机酸，可供给产电菌作为电子供体产电。

［1］ClAASSEN P A M，VAN LIER J B，CONTRERAS A M L，et al.Utilization of biomass for the supply of energy carriers［J］.Appl Microbiol Biotechnol，1999，52(6):741 －755.

［2］DUNN J B，MUELLER S，WANG M，et al.Energy consumption and greenhouse gas emissions from enzyme and yeast manufacture for corn and cellulosic ethanol production［J］.Biotechnology Letters，2012，34(12):2259－2263.

［3］DELIVAND M K，BARZ M，GHEEWALA S H，et al.Environmental and socio-economic feasibility assessment of rice straw conversion to power and ethanol in Thailand［J］.Journal of Cleaner Production，2012，37:29 －41.

［4］ZHENG Y，CHENG Y S，YU C W，et al.Improving the efficiency of enzyme utilization for sugar beet pulp hydrolysis［J］.Bioprocess Biosyst Eng，2012，35:1531 －1539.

［5］任燕锋，陈丽丽，李忠秋，等.甜菜渣饲料资源化利用的现状及发展趋势［J］.中国奶牛，2010(11):22－25.

［6］MOOSAVI-NASAB M，MAJDI-NASAB M.Utilization of sugar beet pulp as a substrate for the fungal production of cellulase and bioethanol［J］.African Journal of Microbiology Research，2010，4(23):2556－2561.

［7］FANG C，BOE K，ANGELIDAKI I.Anaerobic co-digestion of by-products from sugar production with cow manure［J］.Water Research，2011，45(11):3473 －3480.

［8］王慧勇，梁鹏，黄霞，等.微生物燃料电池中产电微生物电子传递研究进展［J］.环境保护科学，2009，35(1):17－20，35.

［9］LOGAN B E，HAMELERS B，ROZENDAL R A，et al.Microbial fuel cells:Methodology and technology［J］.Environ Sci Technol，2006，40(17):5181 －5192.

［10］LIU R，GAO C Y，ZHAO Y G，et al.Biological treatment of steroidal drug industrial effluent and electricity generation in the microbial fuel cells［J］.Bioresource Technology，2012，123:86 －91.

［11］XING D F，CHENG S A，REGAN J M，et al.Change in microbial communities in acetate-and glucose-fed microbial fuel cells in the presence of light［J］.Biosensors ＆ Bioelectronics，2009，25(1):105 －111.

［12］HEILMANN J，LOGAN B E.Production of electricity from proteins using a microbial fuel cell［J］.Water Environment Research，2006，78(5):531－537.

［13］WANG X，FENG Y J，WANG H M，et al.Bioaugmentation for electricity generation from corn stover biomass using microbial fuel cells［J］.Environ Sci Technol，2009，43:6088 －6093.

［14］LIU H，CHENG S A，LOGAN B E.Production of electricity from acetate or butyrate using a single-chamber microbial fuel cell［J］.Environ Sci Technol，2005，39:658 －662.

［15］CHAE K J，CHOI M J，LEE J W，et al.Effect of different substrates on the performance，bacterial diversity，and bacterial viability in microbial fuel cells［J］.Bioresource Technology，2009，100:3518 －3525.

［16］CHEUNG M K，AU C H，CHU K H，et al.Composition and genetic diversity of picoeukaryotes in subtropical coastal waters as revealed by 454 pyrosequencing［J］.The ISME Journal，2010，4(8):1053 －1059.

［17］汤华阳，杜卫东，张学军.焦磷酸测序技术及应用［J］.医学分子生物学杂志，2007，4(3):272－275.

［18］曹广丽.高效利用玉米秸秆的产氢菌种及其产氢性能研究［D］.哈尔滨:哈尔滨工业大学，2010:32.

［19］LU L，XING D F，REN N Q.Pyrosequencing reveals highly diverse microbial communities in microbial electrolysis cells involved in enhanced H2 production from waste activated sludge［J］.Water Research，2012，46:2425－2434.

［20］KLOCKE M，MAHNERT P，MUNDT K，et al.Microbial community analysis of a biogas-producing completely stirred tank reactor fed continuously with fodder beet silage as mono-substrate［J］.Systematic and Applied Microbiology，2007，30(2):139 －151.

［21］ZHANG L X，ZHOU S G，ZHANG L，et al.Microbial fuel cell based on Klebsiella pneumoniae biofilm［J］.Electrochemistry Communications，2008，10(10):1641－1643.

［22］GRABOWSKI A，TINDALL B J，BARDIN V，et al.Petrimonas sulfuriphila gen.nov.，sp nov.，a mesophilic fermentative bacterium isolated from a biodegraded oil reservoir［J］.International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology，2005，55:1113 －1121.

［23］MAGOT M，FARDEAU M L，ARNAULD O，et al.Spirochaeta smaragdinae sp.nov.，a new mesophilic strictly anaerobic spirochete from an oil field［J］.FEMS Microbiology Letters，1997，155(2):185 －191.

［24］BOND D R，HOLMES D E，TENDER L M，et al.Electrode-reducing microorganisms that harvest energy from marine sediments［J］.Science，2002，295(5554):483－485.

［25］BOND D R，LOVLEY D R.Evidence for involvement of an electron shuttle in electricity generation by Geothrix fermentans［J］.Applied and Environmental Microbiology，2005，71(4):2186－2189.

［26］CHAUDHURI S K，LOVLEY D R.Electricity generation by direct oxidation of glucose in mediator-less microbial fuel cells［J］.Nature Biotechnology，2003，21(10):1229－1232.