DAPI染色法在流式细胞术中检测BHK-21细胞周期的探讨

俞宗佑，杨孝朴(．甘肃农业大学动物医学院，甘肃兰州730070;2．中农威特生物科技股份有限公司，甘肃兰州730046)

细胞周期分析对反映一个细胞群体的增殖活性具有重要意义，利用流式细胞术进行DNA含量测定是细胞周期分析的重要手段，目前仍然是广泛使用的方法之一。应用细胞流式技术进行细胞周期检测，其结果不仅受样品固有性、样品的处理方法及荧光染色的影响，而且受分析方法的影响。目前，用于检测细胞周期的染料种类较多，其中碘化丙啶(PI)是常用染料，但嵌入到双链DNA和RNA的碱基对中与之结合，无碱基特异性，因此染色前必须用核糖核酸酶A处理细胞，排除双链 RNA 的干扰［1－2］。4，6-联脒-2 苯基吲哚(DAPI)是DNA特异性的荧光染料，与DNA结合是非嵌入式的，主要结合在A－T碱基区，使用时无需用RnaseA处理细胞，但由于配置紫外激光源的流式细胞仪非常昂贵，大多数实验室都没有配备。因此，利用DAPI标记DNA分析细胞周期的方法尚未成为常规检测方法被普遍采纳，也没有简单的标准实验流程可供参考［3－4］。笔者采用 DAPI标记BHK-21细胞，探索简便易行的DNA检测技术，检测细胞周期中各期的DNA含量，以及时预测规模化培养细胞培养细胞增殖活性的情况，为规模化细胞培养的检测奠定基础。

1 材料与方法

1．1 仪器及试剂 NucleoCounter NC-3000自动化全光谱定量细胞成像分析仪、DAPI试剂盒，均为Chemometec公司产品;细胞计数仪，为INNOVATIS产品;悬浮培养细胞BHK-21，为中农威特生物科技股份有限公司驯化并保存。

1．2 样品的制备 将生长状态良好的BHK-21细胞进行传代批式培养。取生长状态良好的细胞，以4×105个/ml的密度接种于含200 ml培养基的细胞培养三角瓶中，于37℃条件下150 r/min培养。培养过程中，分别在24、48、60 h对细胞取样，并进行细胞形态观察，检测细胞浓度和细胞活力。将样品用PBS冲洗2次，1 000 r/min离心5 min，弃上清液。用冰冻的70%无水乙醇固定，置于4℃条件下备用。

1．3 染色与上机检测 将处理好的细胞样品，每份悬浮于0．5 ml DAPI染色液中，37℃避光染色5 min，取适量染色后的细胞样加入到NC-Slide A8的检测室中，将上样后的NCSlide A8放置于NC3000主机的托盘中，进行上机检测。

2 结果与分析

2．1 细胞形态 在显微镜下观察细胞形态发现，大多数细胞散在分布，单个细胞透亮，边缘光滑，形态长良好。

2．2 细胞生长浓度与活性 在起始浓度为4×105个/ml，经过一段时间培养，0～48 h内细胞密度逐渐呈上升趋势，48 h后继续培养，细胞浓度逐渐呈下降趋势(图1);细胞活性先有所增加，达到最大值后呈下降趋势，直至细胞大部分死亡(图2)。

2．3 细胞周期分析 将DAPI染色后的BHK-21细胞上机进行检测，经NC-3000系统对细胞进行细胞周期分析，结果表明，48 h以前S期和G2/M期的DNA含量总数呈上升趋势，大部分细胞逐进入DNA合成期;培养48 h后，S期和G2/M期的DNA含量总数明显呈下降趋势(图3)。

3 讨论

细胞浓度与细胞活力都是监测细胞质量好坏的重要指标［5］。该试验细胞周期检测结果表明，在细胞培养到48 h，细胞S期和G2/M期含量逐渐呈上升趋势，并达到最高值，同时这一培养时间内细胞密度也达到最大值，且细胞活力高达95%以上，二者的检测结果相一致。该试验结果表明细胞培养开始阶段，培养液中营养丰富，细胞在较低密度下生长，代谢活跃，大部分处在G0/G1期，为下一阶段DNA合成S期贮备足够营养物质和能量，随着培养时间的延长，细胞逐渐向DNA合成期过渡，完成DNA合成，最后进入G2/M，细胞开始分裂增殖。该试验中细胞生长到72 h，大部分细胞被阻滞在G0/G1期，此期细胞明显增多，细胞不能在增殖，表明随着培养时间的延长，细胞培养液中营养物质大量被消耗，同时细胞代谢产生大量副产物，这些因素都严重影响细胞的生长［6－7］。因此，检测细胞周期可预测下一个阶段细胞生长趋势与增殖情况，为规膜化细胞培养提共理论参考。

细胞周期染色方法很多，笔者探讨了DAPI标记BHK-21细胞，结果表明DAPI是一种可靠的DNA检测方法，并且其样本制备更简单、易行。这种染料可作为带紫外激光器的分选仪上检测DNA的最佳选择。虽然PI的DNA染色效果好，适用于普通流式细胞仪上检测(488 nm激发)，但由于其具有毒性，污染后不易清除且不能标记活体细胞等局限性，因此，不适用于在分选仪上检测［8－9］。

笔者借助NC-3000自动化全光谱定量细胞成像分析仪所建立的DAPI染色法简单易行，不必加通透剂，也不分离核，是一种适用于多参数分析的检测细胞DNA含量的方法，而且实验流程更简单、快速，可作为具备紫外激光器的流式细胞仪上首选的DNA荧光染料。能够准确检测细胞周期，为规模化细胞培养过程中监控细胞生长状态提供一种良好的检测方法。

［1］刘锡娟，丁慧荣，张宏．用DAPI和Hoechast33342染色法检测DNA的流式细胞方法探讨［J］．北京大学学报:医学版，2010，42(4):480 －484．

［2］贾永蕊．流式细胞术在DNA检测中的应用［J］．中国医学装备，2010，7(4):4－6．

［3］闫虹．流式细胞术的临床应用［J］．医学检验与临床，2008，19(5):4 －6．

［4］CAMPLEJOHN R S，MACARTNERY J C，MORRIS R W，et al．Measurement of phase fractions in lymphoid tissue com paring fresh verus paraffin embedded tissue and 4，6-diamidino-2-phenylindoledihy drochlorde verus propiumiodide staining［J］．Cytometry，1989，10(4):410 －416．

［5］URBICH C，DIMMELER S．Endothelial progenitor cells:characterization and role in vascular biology［J］．Cire Res，2004，95(4):343 －353．

［6］KRISHAN A，DANDEKAR P D．DAPI fluorescence in nuclei isolated from tumors［J］．J Hislochem Cytochem，2005，53(8):1033 －1036．

［7］KAPUSCINSKI J．DAPI:a DNA-specfific fluorescence probe［J］．Bio-tech Histochem，1995，70(5):220 －223．

［8］MCLNTIRE T L，GOLGDEY S H，BENSON N A，et al．Flow cytometric analysis of DNA in cells obtained from deparaffinized fomalin fixed lymphoid tissues［J］．Cytometry，1987，8(5):474 －478．

［9］FENG Y D，TAO D D，QIN J C，et al．A novel three-parameter flow cytometric analysis for cell cycle［J］．Chin Gem J Clinic Oncol，2005，4(2):76－82．