异甘草素对创伤性脑损伤大鼠神经保护作用的实验研究

姜拓之，杨永明，荔志云

·论 著·

异甘草素对创伤性脑损伤大鼠神经保护作用的实验研究

姜拓之，杨永明，荔志云

目的观察异甘草素(ISL)对创伤性脑损伤大鼠脑组织超岐过氧化物酶(SOD)、丙二醛(MDA)、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和脑含水量的影响，初步观察在创伤性脑损伤(TBI中)的作用，探讨其在TBI后促进脑组织康复的作用机制。方法参照Feeney法建立大鼠脑损伤模型，将动物随机分为假手术组、脑损伤组、ISL治疗组。术后2h ISL治疗组给予ISL 20mg/kg药物灌胃治疗1次/d，模型组和假手术组等量的生理灌胃治疗1次/d，7d后处死。采用终点法测定SOD和MDA,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测脑组织、IL-6和TNF-α含量，干湿重法测量脑组织含水量，HE染色光镜下观察脑皮层及损伤灶组织形态变化。结果与脑损伤组相比，ISL治疗后SOD活性明显升高(P<0.05)，MDA、IL-6、TNF-α及脑组织含水量明显减低(P<0.05)，损伤侧脑皮层及损伤灶组织病理学明显改善。结论ISL可促进TBI大鼠的脑组织具有神经保护作用，其机制可能与降低氧化应激和调节脑组织细胞因子有关。

颅脑损伤； 神经； 异甘草素； 大鼠

近年来由交通事故和地震等自然灾害引起的创伤性脑损伤(traumatic brain injury， TBI)呈上升趋势，其死亡率和致残率高，给患者及家庭造成极大的痛苦，也给社会带来沉重的负担。脑创伤后，损伤灶部位脑组织产生大量的自由基和炎症介质引起神经元水肿和坏死是导致继发性脑损伤的一个重要原因，中药干草的提取物异甘草素(isoliquiritigenin， ISL)具有较为广泛的药理活性，其在神经损伤修复方面有多种作用[1]，本实验通过ISL对TBI大鼠进行干预，探讨其治疗机制。

材料与方法

1实验动物、试剂及仪器

SPF级Wistar 雄性大鼠45只，由兰州军区兰州总医院动物实验科提供，鼠龄2～3个月，体重150～200g，异甘草素(纯度98%)由上海源叶生物科技公司提供,超岐过氧化物酶(SOD)和丙二醛(MDA)检测试剂盒由南京建成试剂公司提供，白细胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)检测试剂盒由上海丰翔生物科技有限公司提供。超低温冰箱由日本三洋公司提供，低速离心机由北京医用离心机公司提供，直接读数分析天平由日本岛津公司提供，全自动酶标仪由中国南京华东电子厂提供，分光光度计由上海天美科学仪器厂提供，恒温水浴箱由上海乔枫实业公司提供。显微镜由日本OLYMPUS公司提供。

2脑损伤模型制作

大鼠用10%水合氯醛(30mg/kg，腹腔注射)麻醉后，参照Feeney法[2]，制作TBI自由落体打击模型(打击直径3mm、深度3mm，打击棒重30g、打击高度30cm、冲击力900g.cm)造成左侧大脑半球局部脑挫裂伤，假手术组仅开骨窗不打击。大鼠出现短暂的四肢抽搐，呼吸暂停为造模成功。

3动物分组及给药

随机分为A组(假手术组)、B组(模型组)、C组(ISL治疗组)，每组15只。术后2h C组给予ISL1%吐温80生理盐水20mg/kg腹腔注射治疗1次/d，模型组和假手术组等量的1%吐温80生理盐水腹腔注射治疗1次/d，共治疗5d。

4双侧前爪肌抓力实验

实验动物于TBI后第5d，各组任取10只大鼠做双侧前爪肌抓力实验，测定前爪肌力，按评双侧前爪肌抓力实验评分标准评分，双侧前爪肌抓力实验评分越高肌力越好，评分完毕后将所有大鼠放回原组。

轻抓取大鼠颈背部皮肤，提起大鼠并使前爪轻触直径0.15mm，长46cm，置于距地面70cm高度上铁丝绳(其下放高3.5cm泡沫箱)。将大鼠2个前爪放在绳上，放开，记录大鼠在绳上的时间。评分标准： 0分： 挂在绳上0～2s； 1分： 挂在绳上3～4s； 2分： 挂在绳上5s； 3分： 挂在绳上5s，将后肢置于绳上。

5干湿比重法脑组织含水量检测

实验动物于TBI后第5d，各组任取5只大鼠，每只经10%水合氯醛2ml腹腔注射麻醉后断头处死，取大鼠损伤侧脑组织体积约0.5ml，去除凝血，用冰冷生理盐水冲洗脑组织表面血迹，滤纸吸去脑组织表面残余水分，用电子天平测其湿重，然后于60℃通风烘烤箱烘烤96h，取出称干重，计算含水量： 脑组织含水量=(湿重-干重)/湿重×100%。

6脑组织SOD及MDA含量、TNF-α和IL-6的检测

实验动物于TBI后第5d，各组随机取5只大鼠，每只经10%水合氯醛2ml腹腔注射过量麻醉后迅速断头取脑， 用冰冷生理盐水冲洗脑组织表面血迹，滤纸吸去脑组织表面残余水分，取受打击部位脑组织约0.2ml用电子天平测其重量后加入9倍体积的磷酸缓冲盐溶液(PBS)制作损伤大脑皮层匀浆， 离心后提取上清液按照说明书步骤进行脑组织匀浆液SOD及MDA、IL-6和TNF-α检测。

7病理切片观察脑皮层及损伤灶组织形态变化

实验动物于TBI后第5d，各组随机取5只大鼠，每只经10%水合氯醛2ml腹腔注射过量麻醉后切开胸腔，经左心室用生理盐水冲至上腔静脉流出液体清亮后再用4%的多聚甲醛冲洗3次，内固定后取脑用冷生理盐水冲洗脑组织表面血迹，滤纸吸去脑组织表面残余水分，浸入4%多聚甲醛固定48h，石蜡包埋，以损伤灶中心制作脑组织矢状位切片,片厚3um，HE染色显微镜放大50倍观察脑皮层及损伤灶组织形态学病理变化。

8统计学处理

结 果

1双侧前爪肌抓力实验评分结果

实验动物于TBI后第5d，A组(3.00±0.51)分； B组(0.52±0.21)分； C组(2.37±0.47)分。B组评分显著低于A组(P<0.01)，与B组比较C组评分明显增高(P<0.01)。

2脑组织含水量、SOD、MDA、IL-6、TNF-α检测结果

实验动物TBI后第5d，B组大鼠脑组织含水量、MDA、IL-6和TNF-α均显著高于A组(P<0.01)，SOD 活性均显著低于A组(P<0.01)； C组脑组织含水量、MDA、IL-6和TNF-α均低于B组(P<0.05)； C组脑组织SOD高于B组(P<0.05)(表1)。

3脑皮层组织形态学观察

A组脑皮层细胞均匀分布，细胞密集，软脑膜连续且完整； B组脑皮层打击灶形成以脑软化灶，创面凹陷，细胞数目明显稀疏，半透明水肿带超出损伤灶延伸至海马，软脑膜膜缺损； C组脑皮层损伤灶细胞数明显增多，伤口已被肉芽组织填平，软脑膜已经形成，并与正常脑组织入脑膜相续，半透明水肿带较B组窄，水肿带主要局限在损伤灶底部，见图1。

表1 ISL对脑损伤大鼠脑组织含水量和细胞因子及氧化应激指标的影响

与A组比较：*P<0.01； 与B组比较：△P<0.05

A组(假手术组)×50 B组(模型组)×50 C组(ISL治疗组)×50

图1 脑皮层组织形态学病理切片观察

讨 论

脑损伤后氧化应激是加重继发性脑损伤的重要机制，脑组织损伤后活性氧如超氧阴离子自由基(O2-)、过氧亚硝基阴离子、羟基自由基可导致组织破坏和细胞死亡。氧化应激可以使细胞直接死亡，还可诱导凋亡程序启动，加重脑损伤。Smith等[3]报道TBI、创伤性脊髓损伤和缺血性脑损伤均可引起氧化应激反应，产生脂质过氧化、蛋白质氧化等，并可以损伤DNA，导致神经细胞死亡。SOD超氧化物歧化酶能催化超氧化物歧化成氧和过氧化氢，MDA是脂质氧化产物，两者成负相关，联合检测可以准确反应组织氧化应激反应水平，可以衡量药物抗氧化应激的有效性[4]。脑水肿是创伤性颅脑损伤一个重要的病理机制，是颅内压增高的主要原因[5]。TBI后，血管壁破坏，血液进入组织间隙，引起血管性脑水肿，损伤区血供减少，细胞缺血引起细胞钠钾泵转运障碍，细胞内钠离子聚集导致细胞水肿，颅内特殊结构系统的损伤可引起脑脊液回流障碍导致脑积水，以上因素均可使颅内压升高，对生命造成巨大威胁。TBI后小胶质细胞和星形胶质细胞的激活早期TNF-α等细胞炎症因子便有升高[6]。Herz等[7]报道IL-6和TNF-α水平增高可引起炎性细胞聚集，血管通透性增高，加重脑组织损伤。Laird等[8]研究显示小胶质细胞过多表达IL-6可促进星形胶质细胞水通道蛋白4(AQP4)表达，加重脑水肿。

中药甘草的提取物ISL具有多中药理活性，杨永明和荔志云[9]报道ISL可以通过调节细胞因子促进TBI大鼠康复。本实验发现TBI大鼠经异甘草素治疗5d后，ISL治疗组脑水肿较模型组明显减轻。脑皮层病理切片放大50倍观察ISL治疗组损伤灶周围水肿带明显小于模型组，损伤灶肉芽组织增生明显多于模型组。ISL治疗组损伤灶已经被肉芽组织完全充填，软脑膜已经形成并且大鼠前爪肌力改善。实验中可见ISL治疗组SOD活性明显高于模型组，ISL治疗组脑组织MDA含量、IL-6和TNF-α含量、脑组织含水量低于模型组，ISL治疗组病理组织形态学观察好于模型组。且脑组织含水量降低与水肿带缩小相吻合，脑组织病理学结果与神经行为学观察相吻合。实验提示ISL通过上调脑组织SOD的活性、减少MDA的生成、降低IL-6和TNF-α的含量，保护TBI大鼠神经组织，其在脑组织其他方面的作用值得进一步研究。

[1] 付亚杰，荔志云.甘草各有效成分对神经保护作用的研究进展[J].国际神经病学神经外科学杂志，2012,39(3)：298-300.

[2] Feeney DM,Boyeson MG,Linn RT,et al.Responses to cortical injury: I. Methodology and local effects of contusions in the rat[J].Brain Res,1981,211(1):67- 77.

[3] Smith JA,Park S,Krause JS,et al.Oxidative stress,DNA damage,and the telomeric complex as therapeutic targets in acute neurodegeneration[J].Neurochem Int,2013,62(5):764-775.

[4] Cheng F,Lu Y,Zhong X,et al.Baicalin’s therapeutic time window of neuroprotection during transient focal cerebral ischemia and its antioxidative effects in vitro and in vivo[J].Evid Based Complement Alternat Med,2013,doi: 10.1155/2013/120261.

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[9] 杨永明,荔志云.异甘草素对创伤性脑损伤大鼠损伤灶修复作用的实验研究[J].创伤外科杂志,2014,16(2):144-146.

Experimentalstudyofisoliquiritigeninneuroprotectionontraumaticbraininjuryinrats

JIANGTuo-zhi，YANGYong-ming,LIZhi-yun

(Department of Neurosurgery,Lanzhou General Hospital of Lanzhou Command,Lanzhou 730050,China)

ObjectiveTo observe the effect of isoliquiritigenin(ISL)on pathological changes and SOD,MDA,IL-6,TNF-α and water content of brain tissue after traumatic brain injury in rats and to investigate its possible mechanism for brain rehabilitation.MethodsRats were randomly divided into 3 groups: sham group,TBI group and ISL group. TBI model was established with the modified Feeney’s method. The ISL group

intragastricly ISL 20mg/kg 1 times/d,the TBI group and sham group received the same amount of physiological gavage 2 hours after surgery. After 7 days rats were sacrificed to measure the SOD,MDA of brain tissue using endpoint method,and ELISA was employed to detect the content of IL-6 and TNF-α,wet-dry weighting method was employed to measure water content in the brain tissue. The pathology of the brain tissues was observed under optical microscope through HE staining.ResultsCompared with TBI group,the content of MDA was decreased,the content of SOD,IL-6 and TNF-α was increased,and the pathology of the brain tissues was improved.ConclusionISL can promote brain tissue rehabilitation of traumatic brain injury in rats. The underlying mechanism may be associated with reduction of oxidative stress and regulation of cytokines of brain tissue.

brain injury; nerves; isoliquiritigenin rats

1009-4237(2015)02-0113-04

R 651.1

A

2012中国人民解放军后勤科研项目(CLZ12J006)

730050 甘肃,兰州军区兰州总医院神经外科

荔志云,E-mail：Lizhiyun456@163.com

2014-06-05；

2014-07-14)

(本文编辑： 郭 卫)

·临床问答·

问题3： 创伤性颅脑损伤致脑疝发生包括哪些部位以及不同部位涉及的大脑结构和相应的临床表现如何？

解答：

脑疝发生部位涉及的组织结构相应的临床表现大脑镰疝扣带回，胼周动脉下肢乏力海马钩回疝动眼神经，大脑脚，大脑后动脉上睑下垂，同侧瞳孔散大，对侧偏瘫；可有意识障碍顶盖疝上丘双侧上睑下垂，上视不能轴位疝基底动脉穿支，中脑脑桥延髓，意识下降、眼球运动障碍、呼吸不规律、呼吸骤停、高血压、心动过缓网状结构小脑扁桃体疝延髓呼吸困难或骤停

(雷 鹏，贺教江 兰州军区兰州总医院神经外科，甘肃 兰州 730050)