KLKB1基因多态性与肺血栓栓塞症的相关性

汪敏讷，许小毛，翟振国，孙 亮，方保民，肖 飞，郭 健

1中国医学科学院 北京协和医学院研究生院，北京1007302北京医院卫生部临床检验中心，北京1007303北京医院呼吸与危重症医学科，北京1007304首都医科大学附属北京朝阳医院北京呼吸疾病研究所北京市呼吸和肺循环疾病重点实验室，北京1000205北京医院北京老年医学研究所，北京100730

KLKB1基因多态性与肺血栓栓塞症的相关性

汪敏讷1，2，许小毛3，翟振国4，孙 亮5，方保民3，肖 飞5，郭 健5

1中国医学科学院 北京协和医学院研究生院，北京100730
2北京医院卫生部临床检验中心，北京100730
3北京医院呼吸与危重症医学科，北京100730
4首都医科大学附属北京朝阳医院北京呼吸疾病研究所北京市呼吸和肺循环疾病重点实验室，北京100020
5北京医院北京老年医学研究所，北京100730

目的 研究KLKB1基因单核苷酸多态性(SNPs)与肺动脉栓塞症(PTE)的关联。方法 以确诊的95例PTE患者为PTE病例组，以90名健康体检者为对照组，采用χ2检验、Logistic回归分析对SNP位点的基因型频率、等位基因和单倍体型进行相关性分析，并在加性、显性和隐性3种遗传模型下对各SNP位点进行相关性分析。结果 rs3733402位点的基因型频率在PTE病例组和健康对照组间的分布差异有统计学意义(P=0．041)，KLKB1基因区域rs2292423、rs4253325和rs3733402 3个位点组成的GTG单倍型分布在PTE组和健康对照组间差异有统计学意义(P=0．040)。结论 汉族人群KLKB1基因区域中的rs3733402位点与PTE的遗传易感性相关。

单核苷酸多态性;肺血栓栓塞症;KLKB1;血浆前激肽释放酶

Acta Acad Med Sin，2015，37(3):274-278

静脉血栓栓塞症包括肺血栓栓塞症(pulmonary thromboembolism，PTE)和深静脉血栓形成(deep vein thromboembolism，DVT)，是一种漏诊率、误诊率、致残率和致死率都非常高的疾病，严重危害人类健康。肺血栓栓塞主要指来自右心或静脉系统的血栓阻塞血管导致的一种病理状态，目前我国缺乏PTE详尽的流行病学资料。近年来，随着临床对该疾病关注的增加，研究人员发现，除了继发因素外，遗传背景的差异也是PTE易感的主要原因之一，所以从分子遗传的角度去解释PTE易感性以及从分子水平对PTE的发病机制进行研究，将对PTE的早期预防、临床诊断与治疗有着不容忽视的作用。研究显示，KLKB1基因是PTE的重要候选基因之一［1-2］，KLKB1编码的血浆前激肽释放酶(plasma prekallikrein，PPK)是血浆激肽释放酶(plasma kallikrein，PK)的前体，也是一种丝氨酸蛋白酶，与十一因子(factorⅪ，FⅪ)有58%的同源相似性［3］。十二因子(factorⅫ，FⅫ)可将PPK转换为PK，高分子量激肽原(high molecular weight kininogen，HMWK)在这个过程中作为辅因子。PK又可以激活FⅫ，放大活化级联反应，两者联合将纤溶酶原激活为纤溶酶，从而与纤溶系统相联系［4-6］。研究证实，KLKB1基因多态性与糖尿病，高血压等多种疾病相关［7］，但其与PTE的相关性研究较少，尤其缺乏中国人群的数据支持。本研究基于前期对KLKB1基因高通量测序数据所提示的3个常见单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms，SNP)变异，在PTE患者及正常人群中进行了相关分析，探讨了KLKB1基因和PTE的关系，以期为PTE的防治提供可能的参考。

对象和方法

对象 2008年11月至2012年3月北京医院及北京朝阳医院呼吸科确诊的PTE患者95例(PTE病例组)，其中，男44例，女51例，平均年龄(53．8± 16．2)岁(34～68岁)，所有病例均来自无血缘关系的汉族人群，严格参照中华医学会呼吸病学分会2001年制定的《肺血栓栓塞症诊断和治疗指南(草案)》［8］，经过核素肺灌注显像和/或螺旋CT、电子束CT或MRI及肺动脉造影发现管腔充盈缺损而确诊。同期在北京医院体检中心体检的健康体检者90人(对照组)，其中，男 45人，女 45人，平均年龄(50．2±13．6)岁(31～69岁)，对照组的性别、年龄与PTE病例组匹配，既往均无心脑血管，血液，内分泌，肝、肾疾病，且无深静脉血栓、PTE病史。两组受试者均符合人体试验伦理学标准。本研究获北京医院伦理委员会批准(2012BJYYEC-054-01)，所有受试者均签署知情同意书。

基因组DNA提取及基因分型方法 所有受试者均空腹采取静脉血0．5 ml，用博尔诚全血基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA，经Nanodrop 2000定量，并经琼脂糖电泳质检合格后置-80℃冰箱保存备用。

rs2292423、rs3733402和rs4253325 3个位点的信息来自前期新一代高通量测序(next-generation highthroughput DNA sequencing，NGS)筛选结果，经过样本量和统计学效能的计算原则，挑选KLKB1基因区段中次要等位基因频率(minor allele frequence，MAF) ＞0．05的3个常见SNP位点，经聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)-Sanger法扩大样本量进行后续分型验证。参照UCSC(refseq GRCH37．p13)数据库选取KLKB1基因3个SNP位点对应的目标区域:用Primer3软件分别设计扩增引物:F1(5’-CTGCCGCTATTGGTGATGAA-3’)，R1(5’-AGGGGAAGCCTAGGAGAGAA-3’);F2(5’-TCTTGTACAGCTTGCCATCG-3’)，R2(5’-ATGTTTGCGTGGCATATGAA-3’); F3(5’-GGTTACTCACAGGTGAAATCCA-3’)，R3(5’-TTCTCAAGCAGCCTATTGTGTT-3’)。PCR反应体系为:模板DNA各1 μl，TaqDNA聚合酶(5 U/μl)0．5 μl，含dNTP混合物 4 μl(各2．5 mmol/L)，前后引物(100 pmol/μl)各0．25 μl，双蒸水39 μl。反应条件: 95℃预变性5 min，95℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸1 min，循环35次;72℃后延伸2 min。PCR产物经2．0%琼脂糖电泳后，使用PCR产物回收试剂盒回收目的条带，送擎科新业生物技术有限公司进行Sanger法测序。采用凝胶成像仪分析其基因型及等位基因。

统计学处理 采用 PLINK 1．07(http://pngu．mgh．harvard．edu/～purcell/plink/)软件分析基因分型结果，首先在对照组中检验所有SNP位点是否符合Hardy-Weinberg平衡定律，然后对符合Hardy-Weinberg平衡定律的SNP位点基因型和等位基因进行分析，采用χ2检验比较各SNP位点等位基因频率和基因型频率的组间差异，计算 χ2值、OR、双侧95置信区间(95%CI)和P值，在各遗传模型(加性模型、显性模型、隐性模型)下采用Logistic回归对各SNP位点进行分析，以Bonferroni校正后的P值(Pa=P×3) ＜0．05为差异有统计学意义。单倍体型采用Haploview v4．2软件进行分析，计算χ2值和P值。

结果

Hardy-Weinberg平衡检验结果及SNP关联分析结果 Hardy-Weinberg平衡检测结果显示，rs2292423(P=0．736及P=0．999)、rs3733402(P=0．837及P=0．968)和rs4253325(P=0．818及P=0．274)3个位点在对照组及PTE病例组中均符合Hardy-Weinberg平衡(表1)。KLKB1基因区域的rs3733402位点基因型频率在PTE病例组和对照组间的分布差异有统计学意义(χ2=4．162，P=0．041)。该位点有3个基因型，分别是野生型AA基因型、杂合型AG基因型和纯合子突变型GG基因型，这3种基因型在PTE病例分布中存在差异。rs2292423(χ2=2．879，P=0．0898)和 rs4253325位点(χ2=0．066，P= 0．798)的基因型频率在PTE病例组和对照组间的分布差异无统计学意义。Logistic回归分析结果显示，在加性模型、显性模型和隐性模型下，经过Bonferroni校正校正后，rs2292423、rs4253325和rs3733402 3个位点的基因型频率在PTE病例组和对照组间的分布差异均无统计学意义(P均＞0．05)(表2)。

连锁不平衡分析和单倍型分析结果 KLKB1基因区域rs2292423、rs4253325和rs3733402 3个位点组成的GTG单倍型分布频率在对照组和PTE病例组中分别为29．8%和40．0%，差异有统计学意义(χ2=4．22，P=0．040);AAG单倍型分布频率在对照组和PTE病例组中分别为34．3%和32．6%，差异无统计学意义(χ2=0．11，P=0．739);ATA单倍型分布频率在对照组和PTE病例组中分别为34．8%和26．8%，差异也无统计学意义(χ2=2．76，P=0．097)。

表1 各SNP位点基因型和等位基因频率在PTE病例组和对照组中的分析［n(%)］Table 1 Analysis of genotype and allele frequencies of the three SNP sites in PTE group and control group［n(%)］

讨论

KLKB1基因区域位于染色体4q35上，其编码的PPK水解后可生成PK［9］，而PK主要的两种作用底物是凝血因子Ⅻ和HMWK［10］。当血液与带负电荷的胶原蛋白(皮肤血管外壁)接触时，凝血因子Ⅻ就转化成凝血因子Ⅻa，后者除了能激活凝血因子Ⅺ外，又可同时激活PK，激活的PK在HMWK促进下又进一步使得凝血因子Ⅻ激活。由此内源性凝血途径被激发，被放大，最终导致纤维蛋白的产生和血栓形成［11］。而HMWK水解会释放缓激肽(bradykinin，BK)，这种物质被认为在调控炎症、血管功能、血压功能和疼痛反应的血浆激肽释放酶激肽系统(plasma kallikreinkinin system，KKS)中有着不容忽视的作用［12-13］。

表2 不同遗传模型下个SNP位点的分析Table 2 Analysis of SNP loci in different genetic models

基因多态性是指在一个生物群体中，同时和经常存在两种或多种不连续的变异型或基因型或等位基因，也被称为遗传多态性。基于人类基因组计划的研究结果，不同个体的DNA序列仅存在0．1%的差异，这些差异90%是SNP，即单个核苷酸转换、插入或缺失而形成的基因多态性。SNP是研究人类家族遗传变异的重要依据，一般认为DNA序列中某特定位点的变异频率低于1%为突变，高于1%为分子多态性。研究候选基因的SNPs及单倍体型能为PTE的临床诊疗提供一定的指导，尽管国内、外相继报道了与PTE相关的SNPs，但由于信息零散且不系统，以及人种、生活习惯、环境因素等的差异，目前所报道的PTE相关SNPs并不能为中国临床诊治提供有价值的参考。

在KLKB1基因3个常见变异中，rs2292423为4号染色体上内含子187158034处由A突变G，rs3733402 和rs4253325分别为 KLKB1基因区域187178473和187175722处发生错义突变，rs3733402(A/G)编码蛋白由丝氨酸(Ser)转变成天冬酰胺(Asn)，而rs4253325(A/T)编码蛋白由精氨酸(Arg)转变成谷氨酰胺(Gln)。本研究结果显示，KLKB1基因外显子区域rs3733402 G＞A与PTE相关，OR值提示其携带可能为PTE的危险因素，而rs3733402 G＞A错义突变也导致Ser143Asn，由丝氨酸转变成天冬氨酸的转变涉及构象的改变，故笔者推测可能会改变KLKB1编码的PK功能改变，影响到凝血、纤溶系统中相应成分的活化或灭活，从而促进血栓形成。本研究结果为接下来的研究提供了方向，今后本课题组将会深入分析KLKB1基因rs2292423该位点发生突变的产物与正常产物的生物学效应进行对比，并对其在血液中的含量及下游产物的含量变化进行研究分析。

值得注意的是，PTE是一种多因素复杂性疾病，可能由多个功能系统间的平衡失调所致，所以多个基因的SNP及其特定组合可能是造成疾病易感性最重要的原因，也将是探究其发病机制，指导临床诊断、药物治疗与预防最有效的方式之一，笔者在前期工作中也研究了血管紧张素原(angiotensinogen，AGT)基因中rs1926723、rs699和rs476 3个SNP在PTE中的临床意义［14］。但由于本研究中基因单一且样本量较小，结论有一定局限性，在以后的实验中需要着眼于更大样本量的多基因联合分析研究。同时，如若将尽可能多的相关基因放在一起，通过国家规范标准最后给出PTE发病风险，并由医疗机构提出进行相应的预防措施，将会对未来PTE的诊断和个体化诊疗提供有意义的参考。

［1］Heit JA，Cunningham JM，Petterson TM，et al．Genetic variation within the anticoagulant，procoagulant，fibrinolytic and innate immunity pathways as risk factors for venous thromboembolism［J］．J Thromb Haemost，2011，9(6):1133-1142．

［2］Austin H，De Staercke C，Lally C，et al．New gene variants associated with venous thrombosis:a replication study in White and Black Americans［J］．J Thromb Haemost，2011，9(3):489-495．

［3］Kaplan AP，Silverberg M．The coagulation-kinin pathway of human plasma［J］．Blood，1987，70(1):1-15．

［4］Kluft C，Trumpi-Kalshoven MM，Jie AF，et al．FactorⅫ-dependent fibrinolysis:a double function of plasma kallikrein and the occurrence of a previously undescribed factorⅫ-andkallikrein-dependent plasminogen proactivator［J］．Thromb Haemost，1979，41(4):756-773．

［5］Schmaier AH．Assembly，activation，and physiologic influence of the plasma kallikrein/kinin system［J］．Int Immunopharmacol，2008，8(2):161-165．

［6］Schmaier AH．The elusive physiologic role of FactorⅫ［J］．J Clin Invest，2008，118(9):3006-3009．

［7］Feener EP，Zhou Q，Fickweiler W．Role of plasma kallikrein in diabetes and metabolism［J］．Thromb Haemost，2013，110(3):434-441．

［8］ 中华医学会呼吸病学分会．肺血栓栓塞症的诊断与治疗指南(草案)［J］．中华结核和呼吸杂志，2001，5(24): 259-264．

［9］Fink E，Bhoola KD，Snyman C，et al．Cellular expression of plasma prekallikrein in human tissues［J］．Biol Chem，2007，388(9):957-963．

［10］Neth P，Arnhold M，Nitschko H，et al．The mRNAs of prekallikrein，factorsⅪ andⅫ，and kininogen，components of the contact phase cascade are differentially expressed in multiple non-hepatic human tissues［J］．Thromb Haemost，2001，85(6):1043-1047．

［11］Peek M，Moran P，Mendoza N，et al．Unusual proteolytic activation of pro-hepatocyte growth factor by plasma kallikrein and coagulation factor XIa［J］．J Biol Chem，2002，277(49):47804-47809．

［12］Renne T，Dedio J，Meijers JC，et al．Mapping of the discontinuous H-kininogen binding site of plasma prekallikrein．Evidence for a critical role of apple domain-2［J］．J Biol Chem，1999，274(36):25777-25784．

［13］Girolami JP，Blaes N，Bouby N，et al．Genetic manipulation and genetic variation of the kallikrein-kinin system:impact on cardiovascular and renal diseases［J］．Prog Drug Res，2014，69:145-196．

［14］陈旭．AGT基因rs1926723、rs699及rs4762多态性与肺血栓栓塞症的相关性研究 ［J］．国际检验医学杂志，2013，9(34):1057-1059．

Association between KLKB1 Polymorphisms and Pulmonary Thromboembolism

WANG Min-ne1，2，XU Xiao-mao3，ZHAI Zhen-guo4，SUN Liang5，FANG Bao-min3，XIAO Fei5，GUO Jian5

1Graduate School，CAMS and PUMC，Beijing 100730，China
2National Center for Clinical Laboratories，Beijing Hospital，Beijing 100730，China
3Department of Respiratory and Critical Care Medicine，Beijing Hospital，Bejing 100730，China
4Beijing Key Laboratory of Respiratory and Pulmonary Circulation Disorders，Beijing Institute of Respiratory Medicine，Department of Respiratory Disease，Chaoyang Hospital，Capital University of Medical Sciences，Beijing 100020，China
5Beijing Institute of Geriatric Medicine，Beijing Hospital，Beijing 100730，China

Objective To investigate the potential correlation between the single nucleotide polymorphisms(SNPs)in the KLKB1 region and pulmonary thromboembolism(PTE)in a Chinese Han population．Methods In this case-control study，95 patients with confirmed PTE were enrolled as the PTE group and 90healthy subjects as the control group．The genotypes，alleles，and haplotypes of the SNPs were analyzed with PLINK 1．07 and Haploview 4．2 software using chi-square test and Logistic regression analysis．SNPs were further analyzed under three genetic models(additive，dominant，and recessive)．Results The distribution of rs3733402 in KLKB1 gene showed significant difference between PTE group and control group(P=0．041)．The distributions of GTG haplotypes consisted of rs2292423，rs4253325，and rs3733402 in KLKB1 gene were also significantly different between PTE group and control group(P=0．040)．Conclusion The rs3733402 locus variation in KLKB1 gene is associated with PTE in Chinese Han people．

single nucleotide polymorphisms;pulmonary thromboembolism;KLKB1;plasma prekallikrein

GUO Jian Tel:010-85133860，E-mail:guojian@cma．org．cn

R563．5;R394;R341．2

A

1000-503X(2015)03-0274-05

10．3881/j．issn．1000-503X．2015．03．005

2015-02-04)

郭 健 电话:010-85133860，电子邮件:guojian@cma．org．cn

国家自然科学基金(81170050)、北京市科技新星计划(z121107002512058)、十二五科技支撑项目(2011BAI11B17)和卫生行业科研专项项目(201302008)Supported by the National Natural Sciences Foundation of China(81170050)，the Science and Technology Nova Plan of Beijing(z121107002512058)，the National Science＆Technology Pillar Program during the 12th Five-year Plan Period(2011BAI11B17)，and the National Department Public Benefit Research Foundation by Ministry of Health(201302008)