皮状丝孢酵母脂肪酸CoA连接酶 （Facl）基因的克隆与分析

尚常花 王忠铭 袁振宏 朱顺妮 秦 磊 吕鹏梅

（中国科学院可再生能源重点实验室 中国科学院广州能源研究所，广州 510640）

皮状丝孢酵母脂肪酸CoA连接酶 （Facl）基因的克隆与分析

尚常花 王忠铭 袁振宏 朱顺妮 秦 磊 吕鹏梅

（中国科学院可再生能源重点实验室 中国科学院广州能源研究所，广州 510640）

从皮状丝孢酵母（Trichosporon cutaneum）中克隆了Facl基因及其5′-上游序列，并对Facl基因及其5′-上游序列进行了分析。根据前期的基因组文库测序结果，获得了898 bp DNA序列。以此为基础，2次使用染色体步移（Genomewalking）方法，分别获得了854 bp和1 236 bp 5＇-DNA序列。根据获得的5＇和3＇端序列，合成引物用于扩增Facl基因的全长DNA和cDNA序列。分析发现，皮状丝孢酵母Facl基因cDNA包含一个1 662 bp的开放读码框，DNA不含内含子序列。同时获得了482 bp的5′-上游序列。在5′-上游序列区域存在一系列预测的顺式作用元件。相似性分析的结果表明T．cutaneum和Rhodococcus erythropolis的Fac l氨基酸序列相似性最高。该研究旨在为后继的Facl基因的功能和表达的研究、油脂代谢的遗传改造奠定基础。

皮状丝孢酵母 Facl基因 5′-上游序列 序列分析

随着化石能源即将耗竭以及生态环境日益恶化，可再生能源受到全世界的青睐。作为可再生能源的一员，生物柴油因其具备可生物降解、清洁、无毒和可再生等优点，引起人们的广泛关注［1］，同时，与传统的石化柴油相比较，生物柴油具有相似的化学特性［2］。目前，生物柴油主要是利用植物油制备，然而大规模发展植物来源的生物柴油将需要占用大量土地以及导致食用油短缺。在这种情况下，微生物油脂成为生物柴油的可持续原料。

产油微生物因具备可产生大量油脂、生长迅速及所产生油脂的脂肪酸组成与植物油相似等特点，被认为是一种可选择的生物柴油原料［3-4］。已经发现许多微生物可以积累油脂，包括细菌、酵母、微藻和丝状真菌。

皮状丝孢酵母（Trichosporon cutaneum）是一种可以同时利用葡萄糖和木糖的产油酵母［5］。T．cutaneum不仅可以利用葡萄糖和木糖，还可以利用各种生物质的水解液，包括玉米芯的酸水解液［6-7］和大米草的水解液［8］等，因此，T．cutaneum用于制备生物柴油具备广泛的应用前景。但是，关于T．cutaneum油脂合成途径调控的研究还非常少，限制了利用基因工程技术对T．cutaneum产油性能进行改造。

脂肪酸CoA连接酶（Facl）可以催化脂肪酸、ATP和CoA合成脂酰CoA。它通过将游离脂肪酸活化为它们的CoA硫酯，在不同的代谢和调控过程中发挥着重要作用，包括油脂生物合成、脂肪酸降解、中间代谢、基因表达、三酰甘油掺入、信号转导和基因表达调控［9-10］。Facl催化的反应通过两步进行。首先，脂肪酸和ATP反应生成脂酰-AMP和焦磷酸。其次，脂酰-AMP和 CoA反应，生成脂酰 CoA和AMP。根据碳链的长度，脂肪酸可以被划分为3种类型：短链（C1-C4），中链（C5-C16）和长链（大于C16）。与Facl在细胞代谢中的多种功能相对应，许多微生物含有可利用不同长度碳链脂肪酸的Facl同工酶［11-12］。

鉴于Facl在油脂代谢调控中的重要功能，本研究从T．cutaneum中克隆了Facl基因并对其进行了分析。该工作为以后Facl基因的功能分析、超量表达研究、抑制表达研究及对T．cutaneum油脂代谢的遗传调控奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

皮状丝孢酵母2.571购买自中国普通微生物菌种保藏管理中心。大肠杆菌（E．coli）DH5α由本实验室保存。

1.1.2 主要试剂和仪器

Taq酶、pMD20-T载体、T4DNA Ligase、Genome walking kit、琼脂糖凝胶回收试剂盒、RNA提取试剂RNAiso Plus reagent、反转录酶 PrimeScript Reverse Transcriptase：大连宝生物公司；PCR仪 Mycycler：Bio-Rad公司；离心机 Centrifuge 5417R：Eppendorf公司；凝胶成像系统Tanon-1600：上海天能科技有限公司；电泳系统DYY-7C：北京市六一仪器厂。

1.1.3 引物序列

引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物根据Genome walking kit试剂盒的使用说明设计。引物序列见表1。

表1 皮状丝孢酵母Facl基因扩增使用的引物

1.1.4 生物信息学分析

同源基因通过NCBI Blast搜索被发现（http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／BLAST／）。潜在的 motif通过 ScanProsite Results Viewer工具被发现（http：／／cn.expasy.org／prosite／）。等电点 p I和分子质量通过Compute p I／Mw工具被计算出（http：／／www.expasy.ch／tools／pi tool.html）。序列比对使用 Clustal W 软件。进化树的构建利用MEGA 4软件。功能域的搜索利用NCBI网站的NCBICD Search在线工具。

1.2 方法

1.2.1 总DNA和总RNA的提取

12 000 r／min离心2 min收集对数生长期的酵母细胞，然后按照CTAB法提取基因组DNA［13］。处于对数生长期的酵母细胞经离心后，去除上清，向细胞沉淀中加入RNAiso Plus reagent，按照试剂盒的说明书提取总RNA。取1μg RNA使用oligo（dT）17引物和反转录酶PrimeScript Reverse Transcriptase进行反转录反应生成cDNA。

1.2.2 Facl基因的 5′Genome walking

本实验室在前期的T．cutaneum基因组文库测序中获得了一个898 bp的Facl DNA片段。根据已获得的T．cutaneum Facl基因的部分DNA序列，设计用于5′Genome walking试验的引物 Facl（5sp1）和Facl（5sp2），按试剂盒的说明书进行 PCR，以获取基因的5′-端DNA序列。由于第1次5′Genome walking没有发现起始密码子。因此根据第1次5′Genome walking的结果，设计出用于第2次5′Genome walking的引物Facl-25sp1和Facl-25sp2。PCR产物回收纯化、连接、转化与重组子检测均按常规的分子生物学试验方法进行［14-15］。阳性重组子送上海英骏生物技术公司测序。

1.2.3 Facl基因全长及5′-上游序列的获得和分析

将得到的T．cutaneum Facl基因的部分DNA序列与2次5′Genomewalking扩增获得的DNA序列进行拼接。根据拼接序列，设计出扩增Facl基因DNA和cDNA全长的引物（Facl-N和Facl-C）以及扩增5′-上游序列的引物 Facl（qs）和 Facl（qa），来验证拼接序列的正确性。使用NCBIBlastx软件进行Facl基因的同源性比对。使用PlantCARE软件对5′-上游序列中潜在的顺式作用元件进行分析。

2 结果与讨论

2.1 Facl部分DNA序列的获得

前期的T．cutaneum基因组文库测序获得了898 bp DNA。利用Blast x软件分析获得的序列。结果显示：T．cutaneum的898 bp DNA序列翻译为氨基酸序列后与Rhodococcus erythropolis的Facl氨基酸序列相似性最高，为99%。与Rhodococcus opacus、Rhodococcus imtechensis和 Rhodococcus sp.DK17的 Facl氨基酸序列相似性分别为87%、87%和86%。上述结果表明所获得的部分序列是Facl基因的序列。

2.2 Facl基因的5′Genome walking结果与分析

根据已获得的Facl基因的部分序列，用5′Genome walking的方法扩增得到了Facl的5′端 DNA。第1次使用 Facl（5sp1）和 Facl（5sp2）进行的 5′Genome walking获得了854 bp序列，该序列与898 bp核心序列重叠，表明获得了正确的DNA 5′端序列。但是，经过Blastx比对，发现得到的DNA 5′端序列不够完整，尚未扩增到起始密码子区域。因此，根据获得的854 bp序列设计引物Facl-25sp1和Facl-25sp2进行了第2次5′Genome walking，获得了1236 bp DNA序列，该序列与第1次5′Genome walking的结果重叠，表明获得了正确的第2次5′Genomewalk-ing结果。分析获得的DNA 5′端序列时，发现了位于起始密码子上游长度为482 bp的5′-上游序列。

2.3 Facl基因全长序列和5′-上游序列的获得

利用设计的Facl基因的DNA全长扩增引物以及5′-上游序列的扩增引物进行验证，表明5′-上游序列及拼接的序列均正确。T．cutaneum Facl开放读码框（ORF）为1662 bp（图1和图2）。使用 BioEdit软件对全长DNA和cDNA序列进行比较，发现T．cutaneum Facl基因不含内含子。

图1 Facl基因的全长cDNA序列

图2 皮状丝孢酵母Facl基因的全长cDNA和DNA

将T．cutaneum Facl氨基酸序列进行Blast p同源性比对后，发现与已知Facl氨基酸序列具有广泛的同源性。利用Clustal W和MEGA 4软件，构建了Facl的系统发育树（图 3）。T．cutaneum Facl与Rhodococcus erythropolis Facl表现出最高的相似性，这符合传统的分类系统。

图3 采用Neighbor-Joining方式根据Facl氨基酸序列构建的系统进化树

2.4 Facl全序列的分析

使用NCBICD-Search进行分析，发现T．cutaneum Facl存在保守的功能域 FACL_like_2、LCFACS_euk和CaiC，这些功能域与合成脂酰CoA相关。在预测的T．cutaneum Facl蛋白序列中发现了保守的ATP结合motif。ScanProsite Results Viewer分析结果表明从197位到208位的序列ILFTSGTSGrPK是预测的ATP结合motif，这是Facl家族的典型特征。T．cutaneum Facl蛋白预测的等电点p I为4.96，分子质量为59.988 ku。

2.5 Facl 5′-上游序列的分析

使用引物 Facl（qs）和 Facl（qa），以 T．cutaneum基因组DNA为模板，进行PCR扩增，获得了482 bp 5′-上游序列。该序列包含典型的启动子元件CAAT box（图4）。此外，还发现了与光照、激素和环境胁迫响应相关的调控元件，包括CGTCA-motif（参与茉莉酸甲酯响应）、TCA-element（参与水杨酸响应）、MBS（参与干旱胁迫应答）和光照响应元件（C-box、CATT-motif、G-box、GTGGC-motif）。这些潜在的顺式作用元件为今后进一步研究环境条件对Facl表达的影响提供了线索。

图4 在皮状丝孢酵母Facl基因的5′-上游序列区域预测的顺式作用元件

3 结论

对从T．cutaneum中克隆到的基因序列和其编码的氨基酸序列进行了分析，并以GenBank中部分细菌及真菌的脂肪酸CoA连接酶氨基酸序列为基础进行了系统进化分析。结果表明扩增所得的序列为编码脂肪酸CoA连接酶的基因，其大小为1 662 bp。

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Cloning and Characterization of a Gene Encoding Fatty Acid CoA Ligase（Facl）from Trichosporon Cutaneum

Shang Changhua Wang Zhongming Yuan Zhenhong Zhu Shunni Qin Lei LüPengmei
（CASKey Laboratory of Renewable Energy，Guangzhou Institute of Energy Conversion，Chinese Academy of Sciences，Guangzhou 510640）

The Facl gene and its 5＇-flanking sequence has cloned from Trichosporon cutaneum and amalysis.Based on the former result of genome library sequencing，898 bp DNA sequence was obtained.Based on the 898 bp DNA sequence，the 5＇genomic DNA was cloned by genome walkingmethod；854 bp and 1 236 bp DNA sequences were amplified respectively in two genomewalking experiments.On the basis of the5＇and 3＇terminisequences，primerswere synthesized to amplify the full-length genomic DNA and cDNA sequence.The full-length Facl cDNA contained 1 662 bp open-reading frame（ORF），while the full-length DNA did’t contain intron sequence.In addition，482 bp 5＇-flanking sequence was obtained.Therewere a number of predicted cis-acting elements in 5＇-flanking sequence.The results of similarity analysis revealed that the highest identity of Facl amino acid sequence could be found between T．cutaneum and Rhodococcuserythropolis.The study has laid foundation for further research on the function and overexpression of Facl gene，genetic manipulation of lipid metabolism as a success.

Trichosporon cutaneum，Facl gene，5＇-flanking sequence，sequences analysis

Q789

A

1003-0174（2015）01-0071-05

国家科技支撑计划（2011BAD14B03），国家自然科学基金（31100189）

2013-09-27

尚常花，男，1980年出生，助理研究员，微生物学

袁振宏，男，1953年出生，研究员，生物质能技术