小麦基因组DNA甲基化研究进展

敖 游 (哈尔滨师范大学，黑龙江哈尔滨150025)

1942年Waddington首次提出表观遗传学(epigenetics)的概念，指出表观遗传与遗传是相对的，主要研究基因型与表型的关系。目前表观遗传学主要研究在DNA序列未发生变异的情况下，而基因功能却发生改变，这种改变可随细胞有丝分裂与减数分裂遗传下去的现象［1－2］。表观遗传变异主要包括DNA和组蛋白的甲基化、乙酰化、磷酸化等共价修饰及染色质结构的变化。DNA甲基化(DNA methylation)是真核生物基因组中最常见的一种DNA共价修饰形式，是表观遗传学的一个重要研究领域，同时，DNA甲基化对于很多生物进程起重要作用，包括基因和转座子沉默、基因组印记、X染色体失活等［3］。笔者对小麦基因组DNA甲基化研究进展进行了综述。

1 DNA甲基化概述

DNA甲基化是指DNA复制后，由DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase，DNMTs)催化，以S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl-L-methfonine，SAM)为甲基(-CH3)供体，将甲基连接到DNA分子的腺嘌呤或胞嘧啶碱基上，进行DNA修饰的过程，此过程并不改变DNA的一级结构。

1.1 DNA甲基化酶 DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase，Dnmt)是催化和维持DNA 甲基化的酶［4］。目前，已知的植物DNA甲基化转移酶按照同源性及功能可分三类:①维持DNA甲基化转移酶(MethyltransferaseI，METI)，其首先从拟南芥中分离出来，如果植物缺失METI，会出现CG位点甲基化降低现象［5］;②染色质甲基化酶(Chromomethylase，CMT)，与METI结构相似，但不同的是其中插入了能与DNA结合的基序。最初是在拟南芥的AtCMT3基因中发现CMT成员，在AtCMT3突变体中导致着丝粒区域CNG位点去甲基化，并激活转座子［6］;③结构域重新甲基化酶(Domains Rearrged Methyltransferase，DRM)，与哺乳动物的从头甲基转移酶(de novo methyltransferase3，DNMT3)家族具有同源性，包括DRM1、DRM2、Zmet3，其作用是对从头甲基化DNA与保持转座子及转基因沉默胞嘧啶的甲基化修饰［7］。

1.2 DNA甲基化修饰方式 DNA甲基化修饰方式有2种:一种是维持甲基化，甲基化酶(如METI和CMT)将甲基从SAM催化转移到未甲基化的胞嘧啶碱基的嘧啶环上，使其完全甲基化。另一种是重新甲基化，甲基化酶(如DRM)催化子链中原母链并未甲基化的胞嘧啶位点甲基化。两者都不改变基因组的碱基序列，在一些蛋白质或RNA的协同作用下，调控基因表达［8］。

1.3 DNA甲基化检测 目前常用的植物DNA甲基化分析的方法有甲基化敏感扩增多态性分析法(MSAP)、高效液相色谱法(HPLC)、亚硫酸盐测序法、甲基化敏感限制性内切酶结合Southern杂交分析法等［9－12］。其中 MSAP分析法与HPLC法在植物DNA甲基化水平及状态时应用较多。由于植株种类、结构及发育时期不同DNA甲基化可能存在差异，使植物DNA甲基化检测变得困难，所以需要根据研究材料选择合适的检测方法。

2 小麦在生物与非生物胁迫下DNA甲基化研究

逆境胁迫是对植物生长在各种不利环境因素下的总称，如干旱、冷冻、高温、高盐、物理化学诱导等非生物胁迫及病原菌侵染、机械伤害、病虫害等生物胁迫。植物在自然生长过程中，逆境胁迫不可避免地影响植物的自然生长。

2.1 小麦在生物胁迫下基因组DNA甲基化变化 生物胁迫为植物提供了一种内在表观遗传进化的动力源。分析生物胁迫下DNA甲基化的变异模式，有利于全面了解DNA甲基化在表观调控中的生物学功能。付胜杰等［13］使用叶锈菌胁迫小麦，应用MSAP技术检测基因组DNA甲基化，未发现叶锈菌诱导稳定且特异DNA甲基化模式的改变，但发现抗病品系与其易感病亲本之间存在甲基化差异位点，然而，Akimoto等［14］用白叶枯病菌侵染经过5-氮杂胞苷处理过的水稻，获得对水稻白叶枯病具有抗性的稳定突变品系。

2.2 小麦在非生物胁迫下基因组DNA甲基化变化

2.2.1 金属离子胁迫的影响。重金属能导致人和动物疾病的发生，并影响基因的转录及表达，这不仅与重金属能引起蛋白质损伤有关，同时与DNA损伤及DNA甲基化异常有关［15］。葛才林等［16］采用 HPLC法，检测了3种不同浓度的重金属离子(Cu2+、Cd2+、Hg2+)胁迫对小麦和水稻各器官DNA甲基化的影响，结果表明，重金属Cu2+、Cd2+、Hg2+胁迫可明显改变作物各器官DNA甲基化水平。作物的叶和穗在各浓度Cu2+、Cd2+、Hg2+胁迫下DNA均能处在高甲基化水平，在较低浓度的Cu2+和Cd2+胁迫下小麦根系发生DNA高甲基化，而在各浓度Hg2+胁迫及较高浓度Cu2+和Cd2+胁迫下小麦根系DNA低甲基化则会出现。黑淑梅［17］通过高效液相色谱法检测不同浓度Cr6+对小麦幼苗叶片及根系DNA胞嘧啶甲基化的影响，结果显示，用浓度5～80 mg/L的Cr6+处理3 d龄期小麦幼苗根系或浓度5～100 mg/L的Cr6+处理10 d龄期的小麦幼苗根系DNA胞嘧啶甲基化水平均升高，而100 mg/L的Cr6+引起了3 d龄期幼苗的根系DNA胞嘧啶甲基化水平降低［17］。因此，小麦经过重金属胁迫处理后，植物体为了降低重金属胁迫的危害，会产生对重金属胁迫的应答机制，可能通过升高DNA甲基化水平抑制相关基因的表达或降低某些位点DNA甲基化而促进相关基因的表达，形成保护机制，增强植物对胁迫的抵抗能力，利于植株生长发育［18］。

2.2.2 低温胁迫的影响。超低温保存技术是在超低温条件下植物细胞的代谢活动降低或停止，保持生物材料的稳定性，在植物种质保存中具有广泛的应用价值［19］。陈芳等［20］将2个品种的小麦种子与幼苗进行处理，即对照组(不进行任何处理)、直接超低温保存组、玻璃化法超低温保存组。首先采用AFLP技术分析超低温保存前后样品基因组DNA序列，结果无变异发生。进一步采用MSAP技术分析超低温保存前后样品基因组DNA甲基化水平，结果显示超低温保存后的材料中以去甲基化变异为主要趋势。因此，低温胁迫可能会导致植物基因组DNA发生去甲基化，因而DNA甲基化水平降低。

2.2.3 盐胁迫的影响。盐胁迫在农业生产领域严重制约着农业健康有序的发展，因此植物耐盐适应性研究一直作为农业领域研究热点［21］。Zhong等［22］采用 MSAP法检测小麦耐盐品种“德抗961”和盐敏感品种“鲁麦15”经盐胁迫后根部的DNA甲基化变化情况，结果显示，经盐胁迫处理后DNA甲基化既有升高又有降低，以甲基化降低为主，由此推测，可能是甲基化降低改变染色体结构，调节基因表达，因而提高了植物的耐盐性。Azadi等［23］用复合区间作图法等分子标记技术绘制出在盐胁迫条件下提高小麦粮食产量的数量性状位点，这对提高小麦产量、促进粮食安全具有重要意义。

3 小麦在物理化学因素诱导下基因组DNA甲基化变化

诱发突变技术在农作物材料创制与品种培育中具有重要意义，在解决世界粮食安全问题上发挥了显著作用。杨震等［24］采用60Co-γ射线处理小麦干种子，γ射线处理对幼苗的苗高和根长都有抑制作用，利用MSAP技术检测小麦幼根和幼叶基因组DNA甲基化相对水平均发生变化，幼苗叶片的DNA甲基化水平相对下降，而根中则有所升高，由此推测，γ射线辐照会改变小麦基因组DNA甲基化方式，从而影响基因组稳定性。陈芳［25］用5-氮杂胞苷对小麦幼苗进行处理，结果表明，浓度在5～50 μmol/L的5-氮杂胞苷可以提高小麦分蘖能力，且影响抽穗、花期、千粒重等;100 μmol/L的5-氮杂胞苷对小麦根和苗生长有抑制效应;采用AFLP对其遗传稳定性研究，结果显示不同浓度5-氮杂胞苷以及处理过程中材料基因组均未发生变异;采用MSAP技术对处理前后样品的DNA甲基化变化进行分析，5-氮杂胞苷处理后的材料均产生了不同程度的甲基化变化，以去甲基化变异为主，且DNA去甲基化的程度随5-氮杂胞苷剂量增大而升高。

4 小麦在外源基因导入时基因组DNA甲基化变化

将外源物质转移到小麦中，是小麦改良的重要途径之一。远缘杂交和多倍化是高等植物进化的主要动力，大多数种子植物在进化过程中都经历了染色体加倍过程。邹宏达［26］用荧光MSAP检测体系，对小－大麦2H异附加系、小－大麦2H异代换系2H(2A)、2H(2B)及2H(2D)整套材料的基因组甲基化模式进行检测，结果表明，大麦的2H染色体导入小麦基因中，导致小麦基因组的甲基化变异，且大麦2H染色体自身也检测到了甲基化水平变化。对大米草及水稻等物种间远缘杂交的研究表明，外源种质的导入可以引起受体基因组DNA甲基化程度及甲基化模式发生改变，杂种后代也会发生有别于亲本的变异［27－28］。聂利红等［29］以母本四倍体小麦SCAUP(AABB)与父本二倍体粗山羊草SQ523(DD)杂交得到人工异源六倍体小麦SCA/SQ(AABBDD)，采用MSAP技术分析小麦从四倍体到六倍体进化过程中甲基化水平及甲基化遗传模式变化，结果显示，F1代的甲基化水平均高于父本与母本，由此推测，小麦从四倍体到六倍体进化过程中对一些功能基因的甲基化来抑制其表达，从而降低异源多倍化造成的影响。

5 小麦的甲基转移酶研究

DNA的甲基化是通过DNA甲基转移酶催化和维持的。DNA甲基转移酶是调节DNA甲基化的功能蛋白，在多种模式生物中的研究已相当广泛。凌娜等［30］采用RACE技术克隆了小麦甲基转移酶基因TaDnMT2，系统分析了该基因在小麦生长发育过程中的表达特性，TaDnMT2基因在不同发育时期的叶、种子及根系中均有较高水平表达，且表达的动态水平与发育进程有关，所以TaDnMT2可能在小麦生长与发育过程中发挥着调控作用。在甲基化参与春化过程已在多数物种得以验证，闫延涛［31］在通过RACE技术克隆得到小麦甲基转移酶基因基础上，以春化处理为变量，研究得出春化后小麦甲基转移酶基因的表达水平下降。这些研究方法为进一步研究甲基转移酶在小麦中表达提供了参考。Thomas等［32］利用来自国际小麦基因组测序协会最新得到的小麦基因组，根据MET1基因序列特征在普通小麦中克隆得到TaMET1，并描述了TaMET1在小麦中的进化史，解释同源染色体组II的优势并解释了DNA甲基化参与小麦基因组中的动力学机制。

6 展望

随着全基因组甲基化测序技术的发展，可以在全基因组范围内确定DNA甲基化的位置及其与基因调控间的关系。同时伴随着小麦基因组测序结果的逐步发展，未来DNA甲基化在小麦遗传育种中定会得到更加广泛的应用。

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