苦参素对实验性自身免疫性脑脊髓炎大鼠MCP-1的影响

田广平，石秋艳(秦皇岛市第二医院神经内科，秦皇岛 066600;河北联合大学附属医院神内重症室;通讯作者，E-mail:tgp 057@sohu.com)

多发性硬化(mutiple sclerosis，MS)是一种常见的中枢神经系统免疫性疾病，目前病因和发病机制不清，且无有效的治疗药物。实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)的生化、免疫学、病理学改变和临床表现与多发性硬化相似，是国际公认的研究多发性硬化的经典动物模型［1，2］。苦参素具有抗炎、调节免疫等作用，本研究通过腹腔注射苦参素注射液的方法对EAE大鼠进行干预，观察EAE大鼠发病率、神经功能评分、病理学及脊髓MCP-1的变化，探讨苦参素对EAE的治疗作用及可能的机制，为其临床治疗MS提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 实验对象与分组

6-8周龄雌性Wistar大鼠90只，体重160-200 g，豚鼠10只，体重400-500 g，雌雄各半，以上动物购自北京维通利华实验动物公司。采用随机数表将Wistar大鼠随机分为正常对照组(n=30)、EAE模型组(n=30)和苦参素治疗组(n=30)。每组取免疫后第7天、第14天、第21天3个观察时间点(相当于发病初期、高峰期及缓解期)，每个时间点10只大鼠。

1.2 药品和试剂

苦参素注射液购自浙江普洛康裕天然药物有限公司;不完全福氏佐剂购自美国Sigma公司;卡介苗购自北京生物制品研究所;兔抗大鼠单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)多克隆抗体购自北京博奥森生物技术有限公司;二抗试剂盒及DAB显色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 EAE模型制备及药物干预

参照徐玉等［3］的方法，应用新鲜豚鼠全脊髓匀浆+完全福氏佐剂制成完全抗原，注射到模型组及苦参素治疗组大鼠四肢足垫皮下(按0.1 ml/足垫)建立EAE模型，正常对照组注射等量生理盐水。自免疫后当天起，苦参素治疗组大鼠给予腹腔注射苦参素注射液150 mg/(kg·d)，EAE模型组大鼠给予腹腔注射生理盐水5 ml/(kg·d)，用药持续到大鼠处死当天停用。正常对照组不给予干预。

1.4 临床神经功能评分

免疫后当天开始每天早、晚2次观察大鼠一般情况并进行神经功能评分［4］:0分，无异常表现;1分，尾部无力;2分，尾部和后肢无力;3分，后肢瘫痪;4分，双后肢严重瘫痪+前肢无力，被动翻身时不能复原;5分，全身瘫痪、濒临死亡或死亡。

1.5 标本取材

各组大鼠分别于免疫后第7，14，21天处死，取脊髓腰膨大处用4%多聚甲醛固定12 h，常规石蜡包埋，间隔50 μm间断切取6张切片，HE染色和免疫组化检测各用3张。

1.6 病理学观察

切片常规HE染色后置于100倍光镜下观察，以小血管周围呈现袖套样炎细胞浸润或超过15-20个炎细胞成簇浸润者为1个炎性病灶进行计数，每张切片随机计数5个不重叠视野，将每只大鼠15个视野炎性病灶相加后取平均数进行统计学处理。

1.7 脊髓MCP-1水平检测

应用兔抗大鼠MCP-1多克隆抗体及二抗试剂盒、DAB显色剂等对脊髓切片行免疫组化染色，在200倍光镜下观察，在白质区随机观测5个不同视野，采用Ipp6.0软件对MCP-1染色强度进行定量分析，结果用平均灰度值表示(灰度值是反映透光密度的定量指标，与蛋白表达量呈负相关，灰度值越低，蛋白表达量越多;反之亦然)。

1.8 统计学处理

2 结果

2.1 各组大鼠发病情况及神经功能评分

各组大鼠无死亡。正常对照组大鼠全程无发病，活动正常。免疫后7-9 d EAE模型组及苦参素治疗组大鼠均发病，表现为体重减轻，尾部及肢体无力、爬行缓慢等，免疫后第14 d左右症状达高峰，发病严重大鼠表现为双后肢或四肢瘫痪，总病程持续9-12 d，多在免疫后21 d缓解。EAE模型组和苦参素治疗组发病率分别为100%和47%。苦参素治疗组大鼠的发病率和发病不同时间点神经功能评分均低于EAE模型组(P＜0.05，见表1)。

表1 实验各组不同时间点神经功能评分比较(±s，n=10)Table 1 Comparison of neurological scores among three groups at different time points(±s，n=10)

表1 实验各组不同时间点神经功能评分比较(±s，n=10)Table 1 Comparison of neurological scores among three groups at different time points(±s，n=10)

与正常对照组比较，△P＜0.05;与EAE模型组比较，#P ＜0.05

组别 第7天 第14天 第21天正常对照组0.0 ±0.0 0.0 ±0.0 0.0 ±0.0 EAE 模型组 1.1 ±0.5△ 3.9 ±1.1△ 1.3 ±0.7△苦参素治疗组 0.4 ±0.5# 1.1 ±0.6# 0.6 ±0.7#

2.2 病理学观察

镜下显示正常对照组大鼠脊髓组织无炎性细胞浸润。EAE及苦参素治疗组大鼠脊髓白质中，大量炎细胞浸润在小血管周围，典型呈现的“袖套”样改变，或大量炎细胞成簇浸润(图1，见第608页)。与EAE模型组比较，苦参素治疗组的炎性病灶数量明显减少，差异有统计学意义(P＜0.05，见表2)。

图1 实验各组第14天时脊髓白质内炎症细胞浸润情况 (HE染色，×100)Figure 1 Inflammatory cells infiltrated in spinal cord in different groups at 14 d (HE staining，×100)

表2 实验各组不同时间点炎性病灶数比较(±s，n=10)Table 2 Com parison of the number of inflammatory focus among three groups at different time points(±s，n=10)

表2 实验各组不同时间点炎性病灶数比较(±s，n=10)Table 2 Com parison of the number of inflammatory focus among three groups at different time points(±s，n=10)

与同时间点正常对照组比较，△P＜0.05;与同时间点EAE模型组比较，#P ＜0.05

组别 第7天 第14天 第21天正常对照组0.00 ±0.00 0.00 ±0.00 0.00 ±0.00 EAE 模型组 1.76 ±0.77△ 3.43 ±1.17△ 2.20 ±0.48△苦参素治疗组 0.00 ±0.00# 1.33 ±0.66△# 0.86 ±0.63△#

2.3 脊髓MCP-1水平比较

MCP-1表达阳性细胞主要为星型胶质细胞，表现为胞质着色，呈棕褐色(图2，见封3)。正常对照组大鼠脊髓内MCP-1阳性细胞少，染色较浅。与正常对照组比较，EAE模型组大鼠脊髓MCP-1灰度值在免疫后第7天时即降低，第14天时降低更加显著，第21天时升高。与同时间点EAE模型组相比，苦参素治疗组MCP-1灰度值明显升高，差异有统计学意义(P＜0.05)，说明苦参素治疗组MCP-1的阳性表达较EAE模型组大鼠降低(见表3)。

3 讨论

苦参素是从中药苦参、苦豆子或广豆根中提取的一种喹嗪啶类生物碱，其中氧化苦参碱的含量＞98%，具有抗病毒、抗炎和抑制自身免疫反应等药理 作用［5，6］。研究发现，苦参素可以减轻EAE大鼠的症状，对EAE有明显的防治作用［7］。本研究显示与EAE模型组大鼠比较，苦参素治疗组大鼠的发病率和神经功能评分降低，脊髓病理学改变减轻，提示苦参素可以抑制EAE大鼠的炎症反应，减轻神经功能损伤的程度，促进临床症状的缓解，这一研究与国内报道相符［8］。

表3 实验各组不同时间点MCP-1平均灰度值比较(±s，n=10)Table 3 Com parison of the average gray of positive staining of MCP-1 among three groups at different time points(±s，n=10)

表3 实验各组不同时间点MCP-1平均灰度值比较(±s，n=10)Table 3 Com parison of the average gray of positive staining of MCP-1 among three groups at different time points(±s，n=10)

与正常对照组比较，△P＜0.05;与EAE模型组比较，#P＜0.05

组别 第7天 第14天 第21天正常对照组177.48 ±10.83 171.73 ±12.04 174.42 ±11.76 EAE 模型组 149.06 ±6.09△ 128.24 ±7.72△ 148.17 ±7.71△苦参素治疗组 176.33 ±7.85# 147.98 ±9.33# 164.78 ±9.15#

EAE是由抗原特异性CD4+T细胞介导的中枢神经系统自身统免疫性疾病。CD4+T细胞通过血脑屏障向中枢神经系统迁移并进一步破坏髓鞘及轴索是EAE发病的关键步骤，血脑屏障附近表达上调的一些免疫介质如趋化因子、黏附分子、金属蛋白酶等细胞因子对这一迁移过程起着重要的调控作用［8］。趋化因子通过与受体结合介导免疫细胞活化并向特定组织浸润、积聚。MCP-1由76个氨基酸组成，属于CC类趋化因子家族，主要与CC类趋化因子受体2结合，是引起单核细胞、巨噬细胞及活化淋巴细胞聚集的重要的趋化因子［10］。MCP-1在EAE中的表达水平明显升高，并且与EAE的临床症状密切相关［11］。研究发现在EAE小鼠中枢神经系统MCP-1的表达水平和动态变化与临床表现一致，提示 MCP-1是 EAE 发病中关键的致炎因子［12，13］。本研究发现，在发病初期，EAE大鼠脊髓MCP-1的表达上调，在症状高峰期MCP-1表达水平升高更加明显，缓解期下降。经苦参素干预后 EAE大鼠MCP-1表达水平明显下降，提示苦参素可以降低EAE大鼠MCP-1的表达，抑制中枢神经系统内的炎症反应。

本研究证实，苦参素可以降低EAE的发病率，减轻脊髓内炎症反应，从而缓解EAE的临床症状。苦参素对EAE的治疗作用可能与其下调EAE大鼠脊髓内MCP-1的表达水平有关。

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