依达拉奉和远隔缺血后处理对心肌再灌注损伤的保护

李知平，张 曙，李恒昌，林永锋，谢海辉(广东省东莞市人民医院麻醉科，东莞 5308;广州市第一人民医院麻醉科;通讯作者，E-mail:lzp3338@63.com)

药物后处理和远隔缺血后处理是近年对抗心肌缺血-再灌注损伤的重大发现，其均是在心肌缺血发生后实施，具有补救作用、操作简单及廉价(远隔缺血后处理)等优点［1，2］。心肌缺血 -再灌注损伤的机制复杂且尚未完全阐明，现有治疗药物或治疗方法比较单一。依达拉奉是一种新型自由基清除剂，以往的动物脑缺血再灌注实验证明可以减轻脑缺血再灌注损伤，理论上讲依达拉奉用于心肌缺血再灌注保护具有很大潜力［3］，所以我们引入依达拉奉后处理和远隔缺血后处理联合应用，以探讨其机制及是否具有协同作用，为心肌缺血-再灌注损伤寻求更加有效的治疗药物和新的治疗途径。

1 资料与方法

1.1 动物选择

健康雄性SD大鼠40只，8周龄，体重250-300 g，由中山大学实验动物中心提供。

1.2 动物分组

采用随机数字表法，将其分为5组(n=8):假手术组(S组)、缺血再灌注组(I/R组)、依达拉奉后处理组(E组)、远隔缺血后处理组(P组)、依达拉奉联合远隔缺血后处理组(EP组)。

假手术组(S组)开胸，冠状动脉左前降支(LAD)穿线但不结扎，观察210 min;缺血再灌注组(I/R组)开胸，结扎LAD 30 min，再灌注180 min;依达拉奉后处理组(E组)开胸，结扎LAD 30 min，在再灌注前1 min经主动脉根部给予依达拉奉3 mg/kg，然后再灌注180 min;远隔缺血后处理组(P组)开胸，结扎LAD至20 min时，同时用止血带结扎大鼠双下肢，LAD结扎至30 min时，同时开放LAD及双下肢，实施心脏再灌注180 min;依达拉奉联合远隔缺血后处理组(EP组)方法同P组，不同的是在同时开放LAD及双下肢前1 min，经主动脉根部给予依达拉奉3 mg/kg，然后再实施心脏灌注180 min。

1.3 远隔缺血后处理方法

在大鼠双后肢中、上1/3部位止血带结扎，颜色呈绛紫色，多普勒超声检查验证股动脉血流完全停止示肢体缺血成功，10 min后恢复再灌注。

1.4 大鼠心肌缺血再灌注模型的建立

腹腔注射3%戊巴比妥钠45 mg/kg，麻醉后仰卧位固定。采用ECGⅡ导联监测心电图。气管切开插管，连接DH.150小型动物呼吸机(浙江大学医学仪器厂)。经右颈总动脉插导管至左心室，连接BL.420E+生物信号采集与处理系统(四川泰盟科技有限公司)，以监测心脏功能指标。沿锁骨中线纵行切开皮肤约2 cm，在第3或第4肋间钝性分离肌层，打开胸腔，剪开心包，在肺动脉圆锥与左心耳之间平左心耳下缘5 mm处行左冠状动脉前降支穿线，并用硅胶管套线，阻断时在贴紧硅胶管的上端用止血钳夹紧线，缺血30 min，ECGⅡ导联ST段明显抬高0.1 mV或T波高耸，心肌颜色变暗红示心肌缺血成功。松开止血钳，抬高的ST段或高耸的T波快速回落示再灌注成功。S组左冠状动脉前降支穿线但不结扎。E组再灌注前1 min静脉注射依达拉奉(批号:86.100205，江苏先声药业有限公司)3 mg/kg;P组心肌缺血20 min时行远隔缺血后处理，持续10 min;EP组远隔缺血后处理方法同P组，依达拉奉给药方法同E组。

1.5 CK-MB、SOD、MDA 测定

CK-MB、SOD、MDA试剂盒均购于南京建成生物工程研究所。CK-MB测定:再灌注180 min末，各组分别从右心耳取血1 ml，在全自动生化分析仪上测定CK-MB;SOD、MDA测定:再灌注180 min末打开腹腔，从下腔静脉取血，分离血清，-20℃保存待测，分别采用硫代巴比妥酸法和分光光度计法测定心肌组织MDA含量和SOD活性，具体操作按照试剂盒说明进行。

1.6 心肌梗死面积测定(infarct size，IS%)

实验结束并抽取动脉血样后，再次结扎LAD，经颈内静脉注射1%伊文氏蓝溶液2-3 ml。待大鼠口唇和远端肢体皮肤蓝染后，经颈内静脉注射10%KCl溶液1-2 ml处死大鼠，迅速摘取心脏并在冰盐水内洗去表面和心室内残血，沿冠状沟切除左、右心房，并将右心室剪去。将留存的左心室用食品保鲜膜包裹后放入-20℃冰箱内保存60 min以上。在分析时将留存的大鼠左心室取出，自LAD结扎处水平向心尖方向垂直于左心室纵轴将冻硬的左心室均匀切成4-5片(厚度为1 mm)。采用数码相机对切片横截面拍照保存后，置入1%氯化三苯基四氮唑磷酸盐缓冲液(pH7.4)中，37℃避光水浴10-15 min。然后将心肌切片放置在10%中性甲醛中固定过夜后，再次对切片横截面利用数码相机拍照。对获得的数码相片，采用Photoshop CS3 Extended软件进行测量处理，以计算心肌缺血危险区和梗死区占总横截面的百分比。将心肌梗死区的百分比数值除以心肌缺血危险区的百分比数值即为IS%值。

1.7 统计学处理

2 结果

与S组相比，其他各组灌注后CK-MB，IS%显著增加(P＜0.01)，I/R组灌注后SOD活力降低，MDA的水平增高，EP组灌注后SOD活力增加(P＜0.05);与 I/R组相比，E组、P组和 EP组灌注后IS%减小，CK-MB、MDA的水平明显降低(P＜0.01)，SOD 活力增加(P ＜0.05);EP组与 E 组、P组比较，CK-MB，MDA水平降低，SOD活力增加(P＜0.05)，IS%明显减小(P ＜0.01，见表1)。

表1 各组大鼠血清生化指标比较(n=8，±s)Table 1 Com parison of serum biomarkers among five groups(n=8，±s)

表1 各组大鼠血清生化指标比较(n=8，±s)Table 1 Com parison of serum biomarkers among five groups(n=8，±s)

与假手术组比较，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;与 I/R 组比较，#P ＜0.05，##P ＜0.01;与联合处理组比较，☆P ＜0.05，☆☆P ＜0.01

指标 时间 假手术组 缺血再灌注组 依达拉奉后处理组 远隔缺血后处理组 联合处理组CK-MB(IU/L) 灌注前 13.5 ±9.6 13.7 ±8.5 13.9 ±6.8 13.8 ±7.4 13.6 ±8.5灌注后 14.5±10.3 2 659±1 358＊＊ 1 138±612##＊＊☆ 1 215±1 018##＊＊☆ 860±136##＊＊SOD(U/ml) 灌注前 98.6 ±7.5 99.2 ±6.9 98.4 ±7.2 99.8 ±8.3 97.9 ±5.6灌注后 100.1 ±6.8 90.3 ±4.9* 101.2 ±5.3#☆ 103.4 ±6.3#☆ 120.8 ±9.4*##MDA(nmol/ml) 灌注前 1.8 ±0.8 1.7 ±0.9 1.8 ±0.6 1.8 ±0.5 1.7 ±1.1灌注后 1.9 ±0.7 4.5 ±2.1* 2.5 ±0.8##☆ 2.6 ±0.5##☆ 1.7 ±0.6##IS(%) 灌注前 0 0 0 0 0灌注后 0 16.3±0.8＊＊ 8.2 ±0.3＊＊☆☆ 8.8 ±1.2＊＊☆☆ 4.2±1.0＊＊

3 讨论

Wang等［4］在大鼠的研究发现，激活 k受体对缺血预处理减少心肌梗死面积和抗心律失常作用均非常重要。Zhang等［5］证实，通过阻断股动脉造成大鼠下肢短暂缺血实施RIP(远隔缺血后处理)的心肌保护作用是由k受体介导的。本研究采用结扎左冠状动脉前降支的方法制备大鼠心肌缺血再灌注损伤模型，该方法是经典的制备心肌缺血再灌注损伤模型的实验方法［6］。药物后处理是指在再灌注时通过药物治疗而获得的保护效应，简便易行，且同样具有重要的临床实用价值。

药物后处理的保护效应已被既往研究所证史［7］，早在 2005 年 Kerendi等［8］即发现了远隔缺血后处理对心肌I/RI的保护作用，但是关于远隔缺血后处理心肌保护作用的机制目前尚未被完全揭示［9］。而且，各研究所采用的远隔缺血后处理方式也不尽相同［9］。Tamareille 等［10］在心肌 I/RI大鼠证实，于心肌缺血20 min时对大鼠后肢实施10 min的缺血和随后再灌注能够显著降低心肌梗死体积。许亚超等［11］在心肌I/RI大鼠证明，于心肌缺血期对大鼠双后肢实施10 min的缺血和随后再灌注亦能产生明显的心肌保护作用。因此，本实验参照既往研究［10，11］采用对心肌I/RI具有确切保护作用的后肢缺血10 min和随后再灌注这一干预方案进行实验研究。而且，本实验结果亦表明，远隔缺血后处理对心肌I/RI具有明确的保护作用，此与既往研究结果相一致［11］。

依达拉奉的保护作用除传统的抑制花生四烯酸脂氧合酶途径外［12］，对羟自由基的有效清除可能是其产生强效心肌保护作用并区别于其他自由基清除剂的优势所在［13］。如果选择合理的给药剂量和途径，依达拉奉药物后处理可起到接近于缺血后处理组的心肌保护作用，二者过氧化产物的减少近似，本实验亦得到印证;更从另一方面证明了抑制自由基氧化应激损伤是缺血后处理保护的重要机制，也是缺血后处理与依达拉奉药物后处理二者保护作用的共同机制。国外也有对急性心肌梗死患者行直接PCI时采用依达拉奉药物后处理减轻再灌注损伤的随机、安慰剂对照临床试验，显示依达拉奉是一种有效的再灌注器官保护药物［14］。MDA是氧自由基攻击生物膜引发脂质过氧化损伤的标志产物［15］，而SOD的活力反应了机体抗氧化应激的能力。本实验发现给予缺血后处理与依达拉奉药物后处理均能明显降低血清MDA水平并提高SOD的活力，说明机械性后处理与外源性给予依达拉奉药物后处理均可大大提高机体的抗氧化能力。因而抑制再灌注早期的自由基氧化应激损伤可能是机械性缺血后处理与依达拉奉药物后处理保护作用的共同机制。

从本实验的结果来看，依达拉奉后处理组和远隔缺血后处理都可减轻心肌缺血再灌注损伤，依达拉奉后处理联合远隔缺血后处理明显效果强于两者单独应用。

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