髓样来源的抑制细胞在舌癌小鼠中的表达及意义

储眉 廖贵清 唐文 周媛 苏宇雄 梁玉洁

1.广州市第八人民医院口腔科，广州 510440；2.中山大学光华口腔医学院·附属口腔医院口腔颌面外科，广州 510055；3.香港大学牙医学院口腔颌面外科，香港 999077

口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）是常见的头颈部恶性肿瘤，目前治疗以手术和放化疗为主，但患者5年生存率无明显提高[1]。OSCC患者存在着较严重的免疫缺陷，因此近年来提高机体免疫系统对抗肿瘤的免疫治疗成为研究热点[2-3]。在肿瘤浸润的白细胞中，髓样来源的抑制细胞（myeloid-derived suppressor cell，MDSC）是免疫抑制作用网络中的重要成员[4]，构成了有着不成熟状态和抑制T细胞增殖作用的髓样细胞的异质群体。本研究建立4-硝基喹啉-1-氧化物（4-nitroquinoline-1-oxide，4NQO）舌癌小鼠模型，观察MDSC在舌癌小鼠中的表达，并探讨其在口腔癌中的意义。

1 材料和方法

1.1 4NQO舌癌模型建立

36只雌性4～6周龄的C57BL/6小鼠及标准固体饲料均由中山大学实验动物中心提供。在无特异病原体条件下饲养，室温18～25 ℃，湿度30%～50%，24 h光暗循环条件下，标准饲料经钴60辐照后喂养。4NQO用双蒸水配制成0.5 g·L-1母液。实验组24只小鼠用避光瓶喂养，4NQO母液用灭菌普通自来水配成50 mg·L-1工作液，每周更换4NQO水，连续饮用16周后，改为饮用普通灭菌自来水至第28周。对照组12只小鼠饮用普通灭菌自来水28周。

1.2 取材及组织病理学观察

在第16、20、24及28周时，6只实验组小鼠及3只对照组小鼠予4%水合氯醛镇静后经眼眶取外周血，处死后取全舌标本。舌标本一半立即冰冻固定用于实时定量聚合酶链反应（quantitative real timepolymerase chain reaction，qRT-PCR）或后续免疫组织化学染色，另一半立即固定于10%中性甲醛缓冲液中，24 h后乙醇梯度脱水，石蜡包埋，4 μm切片，常规苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色。

1.3 免疫组织化学染色

根据组织学结果，实验分为3组：正常对照组12只，异常增生组9只，OSCC组12只。采用葡聚糖聚合物法（labelled dextran polymer method，LDP），切片经脱蜡、修复抗原、灭活内源性过氧化物酶及室温封闭后，滴加anti-Ki67单抗4 ℃孵育过夜。加入二抗室温孵育，二氨基联苯胺（3,3'-diaminobenzidine，DAB）染色，苏木素复染。阴性对照省略一抗孵育步骤。光学显微镜400倍视野下观察切片并计数，计算阳性细胞百分比，每个样本取10个视野，计算均值，表示为标记指数（labeling indices，LI）。

1.4 流式细胞学分析

根据前述组织学结果分为3组的小鼠，再行流式细胞学分析。每只小鼠血液分为两份样本，分别加入30 μL血，一份用抗CD11b和粒性白细胞分化抗原-1（granulocyte-differentiation antigen-1，Gr-1）抗体，另一份用抗CD3、抗CD4和CD8抗体，进行荧光标记并染色。两份标本分别加入红细胞裂解液100 μL，室温裂解并PBS洗涤后进行流式细胞仪检测。

1.5 小鼠病变组织免疫组织化学染色

优化的切片温度（optimal cutting temperature，OCT）包埋的组织制成4 μm冰冻切片，冰丙酮固定，灭活内源性过氧化物酶，室温封闭后，Gr-1单抗1︰10后的切片4 ℃孵育过夜。加入生物素化二抗室温孵育，再加高灵敏度的链霉亲和素（high sensitivity streptavidin，HSS）-辣根过氧化物酶室温孵育后DAB染色，苏木素复染。阴性对照省略一抗孵育步骤。光镜下观察切片。

1.6 qRT-PCR

分组同前述。采用Trizol法提取舌病变组织内总RNA，将提取的总RNA逆转录为cDNA用于聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增。实验引物如下。精氨酸酶1（arginase 1，ARG-1）上游引物序列：5'-GAAGAACCCACGGTCTGTGG-3'，下游引物序列：5'-TCCAACTGCCAGACTGTGGTC-3'； 甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）上游引物序列：5'-CGTGTTCCTACCCCCAATGT-3'，下游引物序列：5'-TGTCATCATACTTGGCAGGTTTCT-3'。PCR反应条件：93 ℃ 3 min，93 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s，共40个循环。将每个样本mRNA水平与相应GAPDH表达水平之比得到目的基因的标准化表达水平，再与正常小鼠的表达水平相比较，计算出表达倍数。

1.7 统计学分析

采用SPSS 16.0软件进行统计学分析，所得数据用均数±标准差表示。MDSC的数值是占外周血细胞的百分比，CD3+CD4+和CD3+CD8+的数值是占淋巴细胞总数的百分比。组间差异的比较采用ANOVA分析。Spearman相关系数用于评价两个指标间的相关性。P＜0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 4NQO诱导小鼠舌组织癌变

在第28周观察期结束时，每只实验组小鼠口腔黏膜都出现一个或以上病变，病变部位多位于舌背黏膜，呈现乳头状或菜花状新生物，伴轻微糜烂现象。随时间延长，实验组小鼠出现了由正常黏膜，经上皮单纯性增生，到异常增生，最终发展成早期浸润癌的组织学变化过程。第16周时6只4NQO诱导（实验组）小鼠有3只（50%）出现异常增生，3只（50%）出现单纯性增生；20周时6只实验组小鼠有4只（67%）出现异常增生，2只（33%）出现浸润癌；24周时6只实验组小鼠有2只（33%）出现异常增生，4只（67%）出现浸润癌；28周时6只（100%）实验组小鼠出现浸润性癌（图1）。同时间点的3只对照组小鼠均未发现异常增生、上皮层次紊乱等变化。根据组织学结果，后续实验分为3组：异常增生组9只，OSCC组12只，正常对照组12只。

图1 小鼠舌黏膜的染色结果 HE × 200Fig 1 Staining results in tongue mucosa of mice HE × 200

2.2 Ki67免疫组织化学染色

正常舌黏膜基底层细胞胞核呈现Ki67阳性染色，LI为20.31%±2.42%；在上皮单纯性增生时，Ki67表达不仅位于基底细胞层，有的甚至累及基底细胞上层，LI为25.08%±2.14%；在上皮异常增生区域，阳性表达进一步增加，LI为31.11%±3.58%；Ki67在OSCC中呈弥散性表达，LI为46.75%±3.46%。单纯增生组、异常增生组和OSCC组LI明显高于正常组（图2）。

图2 小鼠舌黏膜Ki67免疫组织化学染色结果 LDP × 200Fig 2 Ki67 immunohistochemical staining in tongue mucosa of mice LDP × 200

2.3 MDSC细胞和T细胞亚群在外周血的变化

在肿瘤进展过程中，从正常对照组到异常增生和OSCC组，外周血MDSC细胞持续显著增加（P＜0.01）。OSCC组CD3+CD8+细胞百分比较正常对照组与异常增生组明显升高（P＜0.01），但正常对照组与异常增生组间无明显变化（P=0.062）。当3组比较时，CD4+/CD8+比差异有统计学意义（P＜0.01）。配对比较发现各组之间差异均有统计学意义（P＜0.05），然而，CD3+CD4+细胞未发现明显增加（P=0.534）（表1、图3）。

2.4 小鼠外周血中MDSC细胞与T细胞亚群及CD4+/CD8+比相关性分析结果

相关性分析发现，MDSC细胞与CD3+CD8+细胞呈现正相关（r=0.772，P＜0.01），MDSC细胞比例与CD4+/CD8+比呈现负相关（r=-0.830，P＜0.01），但MDSC细胞与CD3+CD4+细胞无明显相关（r=0.181，P＞0.05）。

表1 不同病理分级时小鼠外周血细胞亚群的比例Tab 1 Frequency of peripheral blood cell subsets in mice with different pathological classification

2.5 MDSC细胞在病变组织中的表达

在实验组小鼠的舌黏膜中，表达阳性Gr-1的免疫细胞（MDSC细胞）的细胞膜呈棕黄色（图4）。异常增生区域的MDSC细胞较正常对照组有所增加，在OSCC区域的肿瘤组织内及与正常组织的交界处，均浸润了大量的MDSC细胞。

图3 外周血中MDSC细胞和T细胞亚群细胞流式分析结果Fig 3 Flow cytometric analysis of MDSC and T cell subsets in peripheral blood

图4 MDSC细胞在小鼠舌黏膜中的表达 LSAB × 200 Fig 4 MDSC expression in tongue mucosa of mice LSAB × 200

2.6 口腔病变对酶类基因表达的影响

检测了ARG-1在正常舌黏膜和4NQO诱导的舌黏膜病变部位的表达水平。qRT-PCR结果显示，ARG-1 mRNA在异常增生组织中的表达高于在正常舌黏膜中的表达，而在OSCC中的表达高于正常舌黏膜和异常增生组织中的表达（P＜0.05）。其中，OSCC小鼠舌癌部位ARG-1 mRNA表达水平较正常小鼠舌黏膜显著升高（4.80±1.46）倍（P=0.01）。因此，ARG-1 mRNA的表达是随着肿瘤进展而增加。

3 讨论

舌癌的发生发展是一个多步骤复杂的过程。4NQO作用于口腔黏膜上皮，可能是通过引起DNA的损伤和诱发基因突变，诱导了舌癌的发生发展[5-6]。本研究组织病理学发现4NQO作用后，小鼠的舌黏膜出现了由正常黏膜向癌前病变和鳞癌转变的过程。Ki67免疫组织化学染色结果也同样证实了该过程。Ki67是一种与细胞周期相关的核蛋白，作为增殖标志物常用于检测增殖细胞的表达，其表达量与肿瘤的恶性程度相关[7-8]。

髓细胞生成的异常是肿瘤免疫逃逸的重要原因[9]。这群细胞的增长可诱导T淋巴细胞对抗原刺激的无应答[9-10]，因此被命名为MDSC细胞。MDSC细胞在肿瘤状态下可大量积蓄[2,11-12]。笔者发现4NQO诱导的小鼠随病变进展，外周血中Gr-1+CD11b+MDSC比例逐渐增加，明显高于对照组。这说明MDSC的扩增可能是促肿瘤发展环节中的重要一步。

CD4+和CD8+T细胞在介导抗肿瘤免疫应答中有重要作用[13-14]。本研究发现，随肿瘤进展，外周血中CD3+CD8+T细胞比例逐渐升高，CD4+/CD8+比降低，与正常对照组相比，差异有统计学意义。随肿瘤进展，CD4+/CD8+比的减少可能是由于CD3+CD8+T细胞的扩增所致，这也提示了荷瘤小鼠免疫功能逐渐减弱。Gannot等[15]也发现肿瘤负荷可影响系统免疫应答。本研究还发现MDSC比例与CD3+CD8+T细胞比例存在正相关性，与CD4+/CD8+比显示负相关关系。这提示机体可能通过降低CD4+/CD8+比和提高MDSC比例来影响抗肿瘤免疫应答。这些发现提示MDSC的扩增与肿瘤进展及机体免疫力低下有关。

MDSC在小鼠体内的表型定义为Gr-1+CD11b+的细胞群。OSCC的临床行为可能与肿瘤侵袭前沿浸润炎性细胞的类型有关。Yang等[16]对小鼠乳腺癌组织MDSC采用Gr-1抗体标记后发现，在肿瘤与腺体组织的交界处即肿瘤侵袭前沿浸润了大量的MDSC。本研究免疫组织化学也发现，肿瘤组织中散在分布的MDSC在侵袭前沿表达较丰富，而在正常舌和异常增生舌黏膜区域表达较少。异常增生小鼠的外周血中MDSC较正常小鼠显著增高，然而在舌病变部位异常增生区域表达较少，可能由于异常增生区域诱导分泌的细胞因子和趋化因子较少，造成了MDSC在局部微环境中的变化与循环中的变化的差别。

ARG-1可能参与MDSC诱导的免疫抑制作用[9,17]。本研究发现随舌癌进展，ARG-1 mRNA水平逐渐升高。这提示ARG-1基因水平的上调可能参与了口腔癌MDSC的扩增。在肿瘤微环境中，MDSC中ARG-1的过表达，消耗了局部微环境中L-精氨酸的水平，导致T细胞受体信号通路的失调，使CD8+T细胞无应答[18]。这提示MDSC浸润至肿瘤组织，创造了一个有利于肿瘤进展的微环境，并且可能通过ARG-1发挥免疫抑制作用。

综上所述，本研究显示荷瘤小鼠的舌黏膜出现OSCC时，舌和外周血的MDSC水平显著升高，并与病变部位ARG-1的表达呈正相关关系。这提示MDSC的扩增有可能是肿瘤进展的重要原因，ARG-1基因水平的上调可能参与了这一过程。MDSC可能是口腔癌免疫治疗的新靶点。

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