高效液相色谱法测定牛奶中十二种磺胺类药物残留

王伟，张鹏飞,王丹慧，李梅，于凤玲，薛峰

（1.内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司，呼和浩特011500；2.包头市青山区兴胜镇政府，内蒙古 包头 014030）

0 引言

牛奶检测中经常出现抗生素阳性的现象，尤其是磺胺类抗生素，目前，牛奶中磺胺类检测国标方法只有液相色谱-质谱连用，价格昂贵，且操作复杂，无法大范围推广，GB 29694-2013《食品安全国家标准动物性食品中13种磺胺类药物多残留的测定高效液相色谱法》中检验方法适用于肌肉和肝脏组织的检测，不适用于牛奶中磺胺类药物残留的检测，因牛奶基质与肌肉、肝脏不同，导致使用乙酸乙酯进行提取，回收率太低，无法满足要求，因此，进行液相方法的研究，使用乙腈提取，旋蒸，转换溶剂，除脂，固相萃取，液相-紫外检测。实验方法操作简单，满足相关国标要求，且大部分企业均可满足实验条件，可实现广泛推广。

1 仪器设备和耗材

液相色谱仪：配紫外检测器。

溶剂过滤器：带有0.45 μm水系滤膜。

天平：万分之一天平，十万分之一天平。

旋转蒸发仪：配控温装置。

高速离心机：至少8000转/分。

氮吹仪、漩涡混合器、固相萃取装置。

离心管（50 mL和15 mL）、100 mL或250 mL旋蒸瓶、刻度吸管（1 mL和5 mL）、一次性塑料吸管（3 mL）、试管（15×150）、水系滤膜（0.22 μm）。

2 试剂

以下所用试剂，除特殊注明外均为分析纯试剂，水为符合GB/T 6682规定的一级水。

磺胺醋酰、磺胺吡啶、磺胺甲氧哒嗪、苯酰磺胺、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺氯哒嗪、磺胺甲噁唑、磺胺异噁唑、磺胺二甲氧哒嗪标准品：含量≥99%；磺胺噁唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶标准品：含量≥98%。

乙腈：色谱纯。

甲醇：色谱纯。

盐酸。

正己烷。

甲酸：色谱纯。

氨水。

MCX柱：60 mg/3 mL，或相当者。

0.1 %甲酸溶液：取甲酸1 mL，用水溶解并稀释至1 000 mL。

0.1 %甲酸乙腈溶液：取0.1%甲酸830 mL，用乙腈溶解并稀释至1 000 mL。

洗脱液：取氨水5 mL，用甲醇溶解并稀释至100 mL。

0.1 mol/L盐酸溶液：取0.83 mL，用水溶解并稀释至100 mL。

50%甲醇乙腈溶液：取甲醇50 mL，用乙腈溶解并稀释至100 mL。

3 测定方法

3.1 样品处理

3.1.1 称量和溶解测试样品

称5 g(精确到0.01 g)样品于50 mL离心管中，加入20 mL乙腈，涡旋混合2 min，≥8 000 r/min离心5 min，取上清液于100 mL或250 mL旋蒸瓶中，残渣中加入乙腈20 mL，重复提取一次，合并两次提取液。

旋蒸瓶于低于50℃下旋转蒸发干，用0.1 mol/L盐酸溶液2 mL洗旋蒸瓶，转至15 mL离心管中，再用0.1 mol/L盐酸溶液2 mL洗一次旋蒸瓶，转至同一离心管中，用正己烷3 mL洗旋蒸瓶，转至同一离心管中，重复用正己烷3 mL洗一次，转至同一离心管中，涡旋混合30 s，大于等于8 000 r/min离心5 min，弃正己烷层，取下层液备用。

MCX柱依次用甲醇2 mL和0.1 mol/L盐酸溶液2 mL活化，取备用液过柱，控制流速1 mL/min。依次用0.1 mol/L盐酸溶液1 mL和50%甲醇乙腈溶液2 mL淋洗，用洗脱液4 mL洗脱，收集洗脱液，于低于50℃氮气吹干，用0.1%甲酸乙腈溶液1.0 mL溶解残余物，滤膜过滤，供高效液相色谱测定。

注：如果在检测过程中发现，待测样品的浓度太高，可以将处理样品用0.1%甲酸乙腈溶液进行稀释，然后再进行上机检测，在计算时需考虑稀释倍数。

3.1.2 标准曲线制备

精密量取10 μg/mL磺胺类药物混合标准工作液适量，用0.1%甲酸乙腈溶液稀释，配制成浓度为0、100、200、300、400、500 μg/L的系列混合标准溶液，供高效液相色谱测定。以测得峰面积为纵坐标，对应的标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线。求回归方程和相关系数。

备注：可作单点或多点校准，按外标法。

3.2 仪器参考条件

柱温箱：35℃；

紫外检测器：270 nm；

进样量：20 μL；

色谱柱：C18（250×4.6 mm，5 μm）或其他性能相当者；

流动相：0.1%甲酸+乙腈，梯度洗脱见表1；

流速：1.0 mL/min；

备注：以上仪器条件是参考条件，在实际操作过程中可以根据样品特性和仪器状态做适当调整。

3.3 检出限

3.3.1 定性检出限

磺胺醋酰：10 μg/kg。

磺胺吡啶：10 μg/kg。

表1 流动相梯度洗脱浓度设置

磺胺甲氧哒嗪：10 μg/kg。

苯酰磺胺：10 μg/kg。

磺胺间甲氧嘧啶：10 μg/kg。

磺胺氯哒嗪：10 μg/kg。

磺胺异噁唑：10 μg/kg。

磺胺二甲氧哒嗪：10 μg/kg。

磺胺甲噁唑：10 μg/kg。

磺胺噁唑：10 μg/kg。

磺胺甲基嘧啶：10 μg/kg。

磺胺二甲基嘧啶：10 μg/kg。

3.3.2 定量检出限

磺胺醋酰：25 μg/kg。

磺胺吡啶：25 μg/kg。

磺胺甲氧哒嗪：25 μg/kg。

苯酰磺胺：25 μg/kg。

磺胺间甲氧嘧啶：25 μg/kg。

磺胺氯哒嗪：25 μg/kg。

磺胺异噁唑：25 μg/kg。

磺胺二甲氧哒嗪：25 μg/kg。

磺胺甲噁唑：25 μg/kg。

磺胺噁唑：25 μg/kg。

磺胺甲基嘧啶：25 μg/kg。

磺胺二甲基嘧啶：25 μg/kg。

4 结果

（1）标准曲线。

表2 标准曲线

12种磺胺标准曲线（0 μg/kg ，100 μg/kg，200 μg/kg，300 μg/kg，400 μg/kg，500 μg/kg），相关系数R2均大于等于0.998。

（2）回收率。

表3 牛奶中50μg/kg 12种磺胺混标加标

表4 牛奶中25 μg/kg磺胺二甲基嘧啶加标回收率及变异系数

（3）重复性。

方法规定重复性：在重复条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不超过算数平均值的20%,检测三组平行样数据，结果如下。

表5 12种磺胺混标样品的重复性

（4）精密度。

同时做6组阳性平行样样品，精密度数据见下表6。

表6 12种磺胺类精密度

由此可见，标准曲线、回收率、重复性、精密度都满足GB/T 27404中相关要求。

5 讨论

（1）尝试了丙酮、甲醇、乙醇、乙酸乙酯、乙醚、正己烷做溶剂萃取，回收率普遍为30%-50%之间。

（2）标准曲线工作液需现用现配，磺胺甲基嘧啶标准工作液放置2天后（4℃保存），上机，明显不呈线性。

（3）磺胺甲氧哒嗪、磺胺醋酰、磺胺吡啶可能存在干扰，如无法区分，需用标准加入法判定，或调整梯度洗脱、更改柱温、流速等条件。

（4）样品涡旋混合要混匀，要保证离心效果，否则旋蒸后萃取分层后，中间有大量白色物质（可能为蛋白质），可能会影响回收率。

[1]GB 29694-2013《食品安全国家标准动物性食品中13种磺胺类药物多残留的测定高效液相色谱法》.

[2]万春花.磺胺类药物残留的色谱分析进展[J].现代科学仪器，2008（2）：1-9.

[3]GB/T 27404-2008《实验室质量控制规范食品理化检测》.