骨髓源性EPCs对脊髓源性NSCs增殖分化的影响

张 硕，杜怡斌，杜公文，张 辉，余 涛，方家刘，高维陆，尹宗生

骨髓源性EPCs对脊髓源性NSCs增殖分化的影响

张 硕1，杜怡斌2，杜公文2，张 辉2，余 涛2，方家刘2，高维陆2，尹宗生

目的观察骨髓源性内皮祖细胞（EPCs）对脊髓源性神经干细胞（NSCs）增殖分化的影响。方法通过密度梯度离心法获取骨髓血单个核细胞，以EBM-2进行诱导培养EPCs并进行免疫细胞化学染色鉴定，成熟的方法获取及鉴定SD大鼠的脊髓NSCs，1×105／ml第3代NSCs置于Transwell小室下层与1×105／ml上层原代EPCs进行体外1∶1共培养，以单纯第3代的NSCs培养为对照，培养7 d，双盲法分别计数各组在相差显微镜下神经球形成的数目，并用目镜测微尺测量神经球的平均直径，通过5%血清诱导培养NSCs 7 d后，行β-微管蛋白－Ⅲ免疫荧光染色，Hoechst细胞核染色后在显微镜下计算神经元／细胞总数得出百分率。结果骨髓源性EPCs与脊髓源性NSCs共培养组神经球平均数目为（22.27±3.85）个，平均直径为（61.70±7.21）μm，诱导培养后分化为神经元的平均百分率为（46.10±3.70）%，与对照组比较差异均有统计学意义（P＜0.01）。结论 骨髓源性EPCs能促进脊髓源性NSCs增殖及其向神经元分化。

NSCs；EPCs；增殖；分化；微环境；脊髓损伤

神经干细胞（neural stem cells，NSCs）移植一直是脊髓损伤的主导研究手段，通过促进移植到损伤脊髓中的NSCs有效分化为神经元，促进神经生发，从而达到重建神经通路，促进脊髓神经修复的作用。但大量实验研究［1］显示移植到脊髓中的NSCs最终绝大部分分化成为星形胶质细胞形成瘢痕，神经生发的比例很低。脊髓本身存在一定数量的NSCs（内源性NSCs），NSCs或其他类型干细胞甚至神经组织的移植，其作用都是改善了脊髓损伤后局部的微环境，通过对脊髓NSCs的诱导作用，从而促进神经功能修复［2］。研究［3］表明影响NSCs增殖分化的外在因素包括细胞因子和微环境，是多种细胞因子相互促进影响的结果，脊髓损伤后出血、水肿、缺氧及炎症造成内环境的破坏不利于NSCs神经生发，有效改善脊髓微环境是研究修复脊髓损伤的关键。NSCs所处的微环境中，血管内皮细胞起着重要的营养支持作用，神经生发往往出现于血管生发之后，血管生发为神经生发提供了良好的平台，两者相辅相成，所共处的环境被称为神经血管微环境［4］。内皮祖细胞（endothelial progenitor cells，EPCs）主要来源于骨髓内，并以不同分化阶段存在于外周血，研究［5］表明EPCs及血管内皮细胞能分泌多种细胞因子促进神经的生发，其中主要有血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、脑源性神经营养因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）、胰岛素样生长因子（insulin-like growth factors，IGF）等。该研究采用EPCs与NSCs共培养的方法，观察EPCs对NSCs增殖及向神经元分化的影响，为EPCs移植修复受损神经和治疗脊髓损伤提供相关的实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料骨髓源性EPCs的供体实验动物：SD大鼠，雄性，90～120 g，SPF级；脊髓源性NSCs的供体实验动物：新生SD大鼠，SPF级，5～7 d；均由安徽省实验动物中心提供。EBM-2培养基（CC-3156）由EBM-2与EGM-2 SingleQuots组成，后者含血清10 ml、氢化可的松0.2 ml、成纤维生长因子（fibroblast growth factor，FGF）2 ml、VEGF 0.5 ml、IGF 0.5 ml、抗坏血酸0.5 ml、表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）0.5 ml、GA-1000 0.5 ml、肝素0.5 ml，购自美国Clonetics公司；大鼠骨髓淋巴细胞分离液试剂盒，购自天津TBM公司；鼠纤维联接蛋白（rat fibronectin，FN）购自美国Gene Operation公司；Dil-Ac-LDL购自美国Invitrogen公司；CD133抗体购自美国Biorbyt公司；DMEM／F12（1∶1）培养基、B27、左旋谷氨酸均购自美国Gibco公司；碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）购自美国Peprotech公司；Flk-1抗体、FITC-UEA-1、大鼠Nestin抗体、β-Tubulin（3H3091）抗体均购自美国Santa Cruz公司；24孔板Transwell（孔径0.3 μm）购自美国Corning公司；二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 骨髓源性EPCs分离培养 参考文献［6－7］方法，SD大鼠（90～120 g）颈椎脱臼法处死，消毒后无菌条件下取出双下肢股骨及胫骨，剪去两端干骺端，暴露骨髓腔，一次性注射器抽取F液冲洗收集骨髓血，1 800 r／min离心20 min，弃上清液，沉淀用全血组织稀释液悬起，取等体积C液5 ml加入15 ml离心管，再缓慢将细胞悬液加于C液之上，两个体积比为1∶1，注意保持两者之间的界面清晰，勿使其彼此混合，水平离心机离心，1 500 r／min离心25 min，离心管从上到下依次为稀释液层，薄薄云雾状单个核细胞层，透明分离液层，红细胞层。以毛细管吸出单个核细胞层，以细胞洗涤液离心洗涤细胞2次，弃上清液，细胞沉淀以EBM-2完全培养基重悬，并计数，调整细胞浓度，以5×105／ml细胞浓度接种到预先用FN（10 μg／ml）包被过的24孔板中，每孔1 ml，轻轻晃动培养板使细胞分散均匀，37℃、5% CO2的恒温培养箱培养。2 d后首次换液去除为贴壁细胞，以后隔3 d换液，约9 d左右，细胞融合度达到约90%，即可传代。

1.2.2 骨髓源性EPCs鉴定 参考文献［6－7］方法，EPCs免疫荧光化学染色：取培养8 d的EPCs，孔内培养液吸弃，PBS冲洗，4%多聚甲醛固定20 min，PBS冲洗，0.5%Triton X-100破膜10 min，PBS冲洗后10%山羊血清封闭置于CO2培养箱孵育1 h，吸弃多余血清，滴加小鼠抗CD133（1∶100）及兔抗VEGFR-2（1∶100）一抗，室温过夜，PBS冲洗，加入对应二抗（1∶100），避光孵育1 h，PBS冲洗，添加10 μg／ml Hoechst33342核染色5 min，PBS冲洗，抗荧光淬灭液封片，倒置荧光显微镜观察和拍照。Dil-Ac-LDL与FITC-UEA-1检测：取培养8 d的EPCs，吸弃孔内液体，PBS冲洗后，每孔加入400 μl Dil-Ac-LDL（10 mg／L），CO2培养箱避光4 h后取出，PBS冲洗后4%多聚甲醛固定15 min，PBS冲洗；每孔加入400 μl FITC-UEA-1（10 mg／L），孵育1 h，PBS冲洗，抗荧光淬灭液封片，倒置荧光显微镜观察和拍照。

1.2.3 脊髓源性NSCs分离、培养及鉴定 参考文献［8］方法，5～7 d新生SD大鼠，颈椎脱臼法处死，消毒后在超净台内剪开背部皮肤，无菌条件下取出胸腰段脊髓，剪碎至0.5 mm3大小，反复吹打后200目细胞筛滤去组织杂质，收集悬液离心，1 000 r／min离心5 min，沉淀用NSCs培养基（含10 ng／ml bFGF、20 ng／ml EGF、2%B27和0.6 mg／ml谷氨酰胺的DMEM／F12液）重悬，接种于培养瓶，37℃、5% CO2培养箱培养，2～3 d半量换液，约7～9 d以机械吹打法传代。取状态良好的第3代细胞球行Nestin鉴定。

1.2.4 骨髓源性EPCs对脊髓源性NSCs增殖及分化的影响 参考文献［9］方法，对照组：收集纯化后培养的第3代NSCs细胞球吸管缓慢吹打成单细胞悬液，去除原培养液，以1×105／ml接种于含有涂有多聚赖氨酸的无菌盖玻片24孔培养板，更换培养液为DMEM／F12＋无血清EBM-2（1∶1），37℃、5% CO2的恒温培养箱中培养，每3 d半量换液，培养7 d，观察NSCs生长情况。EPCs和NSCs共培养组：同对照组的基础上在孔内放置24孔板Transwell，取载有贴壁原代生长良好EPCs（细胞融合度达到约90%）盖玻片，EPCs置于Transwell膜上，NSCs位于Transwell膜下。记细胞数为1×105／ml，两者比例为1∶1，37℃、5%CO2的恒温培养箱中培养，每日观察细胞形态变化，培养7 d，100个随机视野下双盲法分别计数各组在相差显微镜下克隆球形成的数目，并随机选取20个视野并用目镜测微尺测量每个视野所有神经球的平均直径（每个神经球的直径＝横径／2＋垂直径／2），取均值，进行统计学分析。观察后，两组均用5%血清诱导培养NSCs 7 d，行β-微管蛋白-Ⅲ免疫荧光染色，Hoechst核染色，随机取20个视野，在显微镜下计算神经元／细胞总数得出百分率，并进行统计学分析。

1.3 统计学处理采用SPSS 13.0软件进行分析，数据以±s表示。两组间比较使用t检验。

2 结果

2.1 EPCs分离、培养及鉴定结果新分离出的骨髓单个核细胞呈圆形，体积较小，见图1A；48 h待细胞贴壁紧密后首次换液，移除悬浮细胞，首次换液后细胞生长加快，可见纺锤形、三角形、圆形等不同形态的细胞，见图1B；第7天可见EPCs的形态特征，以梭形细胞为主，见图1C；第9～10天，细胞迅速增殖，融合度达到80%～90%，可见细胞集落及线状结构形成，见图1D；第12～14天，大部分细胞呈多角形，微血管样生长，见图1E、F。EPCs免疫荧光化学染色结果：骨髓源性单个核细胞体外培养8 d时，行免疫荧光化学检测细胞表面抗原CD133及VEGFR-2表达情况，Hoechst核染色，见图2A；CD133染色的细胞表面呈红色荧光，见图2B；VEGFR-2染色的细胞呈绿色，见图2C；大部分细胞呈双阳性，表明该细胞为EPCs。Dil-Ac-LDL与FITCUEA-1检测：倒置荧光显微镜下观察并拍照，Dil-Ac-LDL细胞摄取呈红色，见图2D；FITC-UEA-1呈绿色，见图2E。

2.2 NSCs分离、培养及鉴定结果新鲜分离的单个NSCs呈圆形，悬浮状，折光性较好，分散存在，2 d后细胞逐渐聚集生长形成5～7个细胞的细胞团，培养7 d，增大至典型的球形（神经球），由数百个细胞构成，悬浮生长于培养基中，见图3A；原代培养7～9 d受周围杂细胞及死亡细胞释放毒性物质的影响，细胞球中央细胞折光性逐渐减弱、周边边境清晰，细胞生长速度较慢，此时机械吹打分离，进行细胞传代，传代后细胞增殖加快，形成的神经球形状规则，呈球形悬浮生长，收集生长状态良好的第3代神经球，Hoechst标记细胞核，见图3B，行抗Nestin抗体染色，见图3C。

2.3 两组NSCs增殖及分化结果倒置显微镜下观察两组NSCs神经球数及球直径的变化，NSCs接种后呈单细胞悬浮生长，2 d后，两组NSCs逐渐聚集形成神经球，但神经球数量及直径无明显区别，4～5 d后，共培养组神经球数比对照组明显多，而且球直径明显增大，于培养7 d后100倍视野下观察，共培养组神经球数比对照组继续增多，球直径继续增大，每组100个随机视野下双盲法分别计数各组在相差显微镜下神经球形成的数目，共培养组为（22.27±3.85）个，对照组为（13.77±2.97）个，两组比较差异有统计学意义（t＝17.463，P＜0.01）；并随机选取20个视野并用目镜测微尺测量每个视野所有神经球的平均直径，共培养组为（61.70± 7.21）μm，对照组为（41.60±4.10）μm，两组比较差异有统计学意义（t＝10.846，P＜0.01）。两组观察后5%血清诱导培养NSCs 7 d后，Hoechst核染色，行β-微管蛋白-Ⅲ免疫荧光染色，随机取个20视野，在显微镜下计算神经元／细胞总数得出百分率，共培养组为（46.10±3.70）%，对照组为（16.95± 3.66）%，两组比较差异有统计学意义（t＝25.046，P＜0.01）。见图4。

3 讨论

脊髓损伤后引起一次机械性组织损伤和二次化学性变性，其中二次变性中关键的是血管的丢失，血流减少引起组织的缺氧、水肿及炎症细胞的渗透，造成内环境的严重破坏，微环境的破坏不利于脊髓内源性神经生发和轴突再生［3，10］。调节NSCs分化的分子机制尚不太清楚，目前研究［11－13］表明，除了NSCs固有性状外，其外在的微环境包括生长因子、细胞因子及细胞间接触等在NSCs增殖分化过程中都扮演了重要角色。NSCs所处的微环境主要由5种细胞构成：NSCs、传递放大细胞、神经母细胞、室管膜细胞和血管内皮细胞，室管膜细胞被认为是一种潜在的内源性NSCs，血管内皮细胞则起着重要的营养支持作用［4］。

EPCs能够分泌多种细胞因子如BNDF、VEGF、IGF等均被证明能够促进神经生发［11－13］。EPCs是一种异质性的细胞群体，主要来源于骨髓复杂的前体细胞，并以不同的分化阶段存在于外周循环中，骨髓中EPCs的含量远超过外周血，骨髓源性的EPCs能以血管发生的方式参与出生后的生理与病理性的血管形成，作为内皮细胞的前体细胞，能够选择性地归巢受损或者缺血部位，参与局部的血管发生，从而形成血管，促进内皮的修复。

脊髓损伤后骨髓源性EPCs的移植能够促进局部新生血管的形成以及反应性星形胶质细胞聚集，减少炎症细胞渗透［10］。在体外分离获得脊髓损伤后出现的反应性星形胶质细胞，发现其具备NSCs的特点，并能够分化为神经元，脊髓损伤后反应性星形胶质细胞大量增加［14］，能够广泛表达VEGF受体-3［15］，而VEGF又有明确的促神经生发作用［12］，EPCs主要表达的细胞因子就是VEGF，这就充分利用反应性星形胶质细胞的NSCs特性将解决内源性NSCs的数量问题。

由于骨髓源性EPCs与脊髓源性NSCs两种细胞的增殖周期及生长特性不同，本实验采用Transwell经典共培养系统，两者比例为1∶1，接种细胞浓度为1×105／ml，并设立对照组。7 d后，高倍镜下共培养组神经球数量比对照组明显多，而且直径更大；EPCs共培养NSCs分化的结果提示：共培养组β-tubulin-Ⅲ阳性率为46.10%，对照组β-tubulin-Ⅲ阳性率为16.95%。与对照NSCs组相比，共培养组EPCs明显促进NSCs的增殖及其向神经元分化。这可能与EPCs作为内皮细胞的前体细胞能够分泌VEGF、BDNF、IGF、PEDF型胶原等多种细胞生长因子，通过Transwell小室中细胞不能通过聚碳酸脂膜作用于NSCs，这种调控相对于加细胞因子更具有安全性和持久性，为NSCs提供合适的微环境，促进NSCs的增殖及其向神经元分化。但两者之间主要作用机制有待进一步验证。

［1］ Pluchino S，CusiRemodelling the injured CNS through the establishment of atypical ectopic perivascular neural stem cell niches［J］.Arch Ital Biol，2010，148（2）：173－83.

［2］ Jin K，Xie L，Mao X，et al.Effect of human neural precursor cell transplantation on endogenous neurogenesis after focal cerebral ischemia in the rat［J］.Brain Res，2011，1374：56－62.

［3］ Burdick J A，Vunjak-Novakovic G.Engineered microenvironments for controlled stem cell differentiation［J］.Tissue Eng Part A，2009，15（2）：205－19.

［4］ Goldberg J S，Hirschi K K.Diverse roles of the vasculature within the neural stem cell niche［J］.Reg Med，2009，4（6）：879－97.

［5］ Di Stefano R，Barsotti M C，Armani C，et al.Human peripheral blood endothelial progenitor cells synthesize and express functionally active tissue factor［J］.Thromb Res，2009，123（6）：925－30.

［6］ Asahara T，Murohara T，Sullivan A，et al.Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis［J］.Science，1997，275（5302）：964－7.

［7］ Amini A R，Laurencin C T，Nukavarapu S P.Differential analysis of peripheral blood-and bone marrow-derived endothelial progenitor cells for enhanced vascularization in bone tissue engineering［J］. J Orthop Res，2012，30（9）：1507－15.

［8］ Yin Z S，Zhang H，Wang W，et al.Wnt-3a protein promote neuronal differentiation of neural stem cells derived from adult mouse spinal cord［J］.Neurol Res，2007，29（8）：847－54.

［9］ Teng H，Zheng Z G，Wang L，et al.Coupling of angiogenesis and neurogenesis in cultured endothelial cells and neural progenitor cells after stroke［J］.J Cereb Blood Flow Metab，2008，28（4）：764－71.

［10］Kamei N，Kwon S M，Kawamoto A，et al.Contribution of bone marrow-derived endothelial progenitor cells to neovascularization and astrogliosis following spinal cord injury［J］.J Neurosci Res，2012，90（12）：2281－92.

［11］Horne M K，Nisbet D R，Forsythe J S，et al.Three-dimensional nanofibrous scaffolds incorporating immobilized BDNF promote proliferation and differentiation of cortical neural stem cells［J］.Stem Cells Dev，2010，19（6）：843－52.

［12］Sun Y，Jin K，Childs J T，et al.Vascular endothelial growth factor-B（VEGFB）stimulates neurogenesis：evidence from knockout mice and growth factor administration［J］.Dev Biol，2006，289（2）：329－35.

［13］Lunn J S，Pacut C，Backus C，et al.The pleotrophic effects of insulin-like growth factor-Ⅰon human spinal cord neural progenitor cells［J］.Stem Cells Dev，2010，19（12）：1983－93.

［14］Buffo A，Rite I，Tripathi P，et al.Origin and progeny of reactive gliosis：A source of multipotent cells in the injured brain［J］. Proc Natl Acad Sci U S A，2008，105（9）：3581－6.

［15］Shin Y J，Choi J S，Choi J Y，et al.Induction of vascular endothelial growth factor receptor-3 mRNA in glial cells following focal cerebral ischemia in rats［J］.J Neuroimmunol，2010，229（1－2）：81－90.

The effects of bone marrow-derived endothelial progenitor cells on the proliferation and differentiation of spinal cord-derived neural stem cells

Zhang Shuo1，Du Yibin2，Du Gongwen2，et al
（1Dept of Orthopaedics，The Fourth Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022；2Dept of Orthopaedics，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022）

ObjectiveTo investigate the effects of bone marrow-derived endothelial progenitor cells（EPCs）on the proliferation and differentiation of spinal cord-derived neural stem cells（NSCs）.MethodsBone marrow mononuclear cells were isolated by density gradient centrifugation methods and EPCs were cultured by EBM-2 basal medium，identified by fluorescent immunocytochemistry.Spinal cord-derived NSCs were isolated，cultured and identified by the mature methods.1×105／ml tertiary NSCs were plated on the base of culture wells，the upper transwell compartment was seeded with 1×105／ml primary EPCs，EPCs and NSCs（1∶1）were co-cultured in vitro，set the untreated tertiary NSCs as a control group.7 days after co-culture，the number and diameter of neurospheres were calculated and measured with the double blind method.After that，NSCs were maintained for 7 days in DMEM／F12＋5%serum medium，and immunochemically stained with neuronal specific marker β-tubulin-Ⅲ，ratio of positive cells to total cells was calculated.ResultsThe average number of neurospheres in co-culture group was（22.27±3.85）and the average diameter was（61.70±7.21）μm.The percentage of neurons immunostaining was（46.10±3.70）%，differences are statistical significance compared with the control group（P＜0.01）.ConclusionBone marrow-derived EPCs promote the proliferation of spinal cord-derived NSCs and induce the differentiation of spinal cord-derived neural stem cells into neurons.

neural stem cells；endothelial progenitor cells；proliferation；differentiation；niche；spinal cord injury

R 681.54

1000－1492（2015）01－0020－05

2014－09－25接收

国家自然科学基金（编号：81171173）；安徽省自然科学基金（编号：11040606Q25）

1安徽医科大学第四附属医院骨科，合肥 2300222安徽医科大学第一附属医院骨科，合肥 230022

张 硕，男，硕士研究生；尹宗生，男，教授，主任医师，博士生导师，责任作者，E-mail：yinzongsheng1961＠sina.com