载体红细胞肿瘤治疗应用研究进展△

温旭智 杨觅 胡静 任伟 刘宝瑞 钱晓萍

南京大学医学院附属鼓楼医院肿瘤中心，江苏南京210008

载体红细胞肿瘤治疗应用研究进展△

温旭智 杨觅 胡静 任伟 刘宝瑞 钱晓萍#

南京大学医学院附属鼓楼医院肿瘤中心，江苏南京210008

目前随着人们对疾病治疗的深入研究，药物载体渐渐成为一个研究热点，特别是在抗肿瘤药物载体方面，载体红细胞就是其中一种。国内外因其循环时间长、生物相容性、生物可降解性等优势对其进行深入的研究。本文就目前国内外载体红细胞抗肿瘤研究及应用进展方面做简要综述。

红细胞；药物载体；抗肿瘤

目前恶性肿瘤的发病率逐年增长，发病年龄也呈现年轻化趋势，因此对肿瘤学方面的研究也更加被人们所重视。然而人们对恶性肿瘤的研究已不仅局限在治疗方面，更体现在肿瘤药物的使用。肿瘤药物的作用往往在抑制肿瘤细胞的同时，对机体增殖旺盛的细胞，如骨髓细胞也有一定的影响。因此使用高效、低毒药物载体运送药物，是降低药物不良反应、减少药物剂量、提高药物疗效的最佳方法。

近二十年来，关于药物载体的研究显示，载体红细胞因具有良好生物相容性、生物可降解性、体内循环时间长而备受关注。另外，红细胞作为载体有以下优势：资源丰富、易获得；具有较大的表面积和体积，为药物包载提供了大量的空间，提高载药率；外观为双凹形，具有极大的变形能力，可使其顺利通过直径仅3～4μm的毛细血管[1-3]。因此，人们将红细胞作为载体进行了更深入的研究，发现通过从生物体血液样本中将红细胞分离出来，采用不同技术将药物等包埋入红细胞即可形成载体红细胞，并可将载体红细胞回输到人、生物体内。在众多研究中也不乏对抗肿瘤药物包埋及应用的研究。现将载体红细胞抗肿瘤研究及应用总结如下。

1 载体红细胞的制备

按照载体红细胞制备原理，目前载抗肿瘤药物红细胞载药体系的制备可分为两类，包括：细胞内包埋型、细胞膜连接型，具体总结如下[4-7]。

1.1 细胞内包埋型

此类细胞内包埋型是指通过改变一定的外界条件或红细胞的某种性质使被包载的药物进入红细胞内，从而形成载体红细胞。具体方法包括，以渗透压改变为基础的制备方法有：低渗稀释法、低渗溶血法、低渗预膨胀法、低渗透析法。此类方法原理为：当红细胞处于轻度低渗（约为150 Osmmol/kg H2O）的环境中，外界水分可进入红细胞使之发生可逆性膨胀至原体积的125%，使红细胞变为椭圆形，达到溶血临界点时，红细胞膜上一些直径为20～50 nm的孔隙将短暂开放，药物可经这些孔隙进入红细胞腔，而当周围环境恢复等渗状态时，红细胞又可恢复原来状态，细胞膜上的孔隙也将恢复，药物即包载于红细胞内。低渗稀释法、低渗溶血法的包载率、利用率低，同时对红细胞损伤较大；而低渗预膨胀法、低渗透析法是目前常用的两种包载方法，其包埋效果好、细胞恢复好。其中低渗透析法可通过专门的设备大规模地制备载体红细胞，适合在基层血站或医院输血科推广使用；而低渗预膨胀法操作更加简单，同时也是此类方法中包载率最高的。另外此类方法中还包括：二甲亚砜诱导的渗透压脉冲法、介电张力法、化学干扰法、以及脂质体、囊泡、细胞融合法等，其中细胞穿膜肽（cell-penetrating peptides，CPP）介导的细胞内陷法[8]，这是目前载体红细胞抗肿瘤研究中比较新颖的载药方法，具体是利用细胞穿膜肽携带大分子物质直接穿透细胞膜进入细胞。这种方法避免了对细胞膜化学或物理性质的损伤及红细胞内重要物质的丢失。目前在红细胞载体方面运用成功的有，通过CPP介导携带门冬酰胺酶进入红细胞内的载药方法，主要应用于治疗急性淋巴细胞白血病。

1.2 细胞膜连接型

此类表面连接方式可以减少对载体红细胞的损伤及对生物相容性的影响，特异性较高。主要包括：红细胞生成素受体（EPOR）介导连接[9]、红细胞表面补体受体Ⅰ型（E-CR1）介导连接[10]、经化学键连接等。其中，药物作为配体与载体红细胞表面修饰的抗体结合，Mukthavaram等[11]指出，以抗CD20抗体修饰载体红细胞，并将利妥昔单抗与抗CD20抗体结合形成利妥昔单抗载体红细胞，动物实验证明利妥昔单抗载体红细胞相对于利妥昔单抗脂质体对表达CD19+/CD20+/CD45+的人淋巴瘤细胞具有较高抑制率，甚至高于90%。

2 载体红细胞的修饰

很多抗肿瘤药物载体不能发挥很好的优势，主要原因是缺乏靶向性、无法控释药物等。据相关研究报道，对载体红细胞进行修饰能够获得良好的生物靶向性，并且通过不同的修饰方法可选择性地作用于不同器官，同时可以提高载体红细胞的稳定性及控制药物的释放。修饰方法主要包括：戊二醛、带3蛋白（Band3）交联试剂、变性处理、磁化[12]等，其中在抗肿瘤研究方面，戊二醛及带3蛋白（Band3）交联试剂值得进一步探讨，具体分析如下。

2.1 戊二醛

戊二醛为常用的细胞交联和固定剂，其能够与细胞膜上的蛋白交联，增加细胞膜的稳定性，从而避免红细胞溶血，也可减缓药物从细胞内流失，同时具有一定靶向性[13]。动物实验证实，高浓度戊二醛处理过的载体红细胞靶向定位于肝脏，而低浓度戊二醛处理过的载药红细胞则靶向定位于脾脏。吴江等[14]实验证明经0.25%戊二醛溶液处理的载长春新碱红细胞药物释放明显减慢，相对于未处理的红细胞，长春新碱的释放速度下降了70%以上。但经此法处理的载体红细胞渗透脆性增加，细胞变形能力降低，不易通过细小毛细血管，限制了其应用。

2.2 带3蛋白（Band3）交联试剂

带3蛋白包括有BS3[bis（sulfosuccinimidyl）suberate，双琥珀酰亚胺辛二酸酯钠盐]、ZnCl2、DTSP [3，3′-二流代双（磺酸琥珀酰亚氨基丙酸酯）]。在衰老或变性红细胞膜上带3蛋白交联成簇，提高自身免疫球蛋白G（Immunoglobulin G，IgG）的连接能力，更易被巨噬细胞吞噬。因此，带3蛋白交联试剂处理的载体红细胞具有巨噬细胞靶向性。Lotero等[15]用BS3处理分别携带依托泊苷的载体红细胞，体外实验提示巨噬细胞吞噬率从3%提高到11%，并且经带3蛋白与巨噬细胞形成牢固连接，体内实验提示处理后的红细胞具有肝靶向性。

3 载体红细胞药物包载

随着载体红细胞在药物包载方面的研究逐渐深入，载体红细胞成功包载的药物种类也随之增多，包括细胞抑制剂、抗生素、激素、维生素、疫苗、酶类、吗啡、苯丙氨酸解氨酶等[16-19]，其中载门冬酰胺酶红细胞已应用于临床治疗急性淋巴细胞白血病[20]，载体红细胞包载的抗肿瘤药物也有很多，以下是近几年研究较多的载体红细胞包载的抗肿瘤药物。

3.1 长春新碱

施莹等、吴江等[21-22]对载体红细胞包载长春新碱做了一系列临床前的研究。运用改良的低渗预膨胀法成功将长春新碱包载入载体红细胞中，并对载长春新碱红细胞特性进行了一系列的体内外实验研究。实验证明红细胞总载药率为（61.42± 3.69）%，载体红细胞回收率为（90.61±4.95）%。载体红细胞渗透脆性减低，形态无明显变化，体积略有增大与载药量成正比，药物释放缓慢，4 h连续释放率为（11.35±1.65）%，可稳定贮存5 d。对于载长春新碱红细胞体内特性的研究，在小鼠体内实验中设置了长春新碱组、长春新碱载药红细胞组、未载药红细胞组和阴性对照组，实验结果证实，长春新碱载药红细胞组在血浆中浓度稳定而持久，72 h后仍可测出，药物半衰期达4.1 h，是长春新碱组的2.68倍。载药红细胞在肝脏及肿瘤中的浓度和稳定性均高于游离药物，且随着时间延长，这种优势也愈加显著。载长春新碱红细胞组对小鼠移植瘤抑瘤率达42.42%，是长春新碱组的2.43倍，并且小鼠体质量增长明显大于长春新碱组。综上说明红细胞可用来包载长春新碱，包载率高，生物学特性无明显改变；增强了抗肿瘤效果，延缓药物释放，延长药物作用时间；增强了药物向肝脏及肿瘤的靶向聚集，减少了不良反应。

3.2 甲氨蝶呤

袁盛华等[23]对红细胞包载甲氨蝶呤做了临床前研究。利用高渗法包载甲氨蝶呤，包封率最高达41.58%。在成功包载后进行一系列体内实验，提示载甲氨蝶呤红细胞相对于裸药甲氨蝶呤血药浓度高峰从（13.6±3.7）mg/L下降至（2.7±1.2）mg/L，半衰期从（3.9±0.8）h延长至（13.5±2.0）h，说明载甲氨蝶呤红细胞具有缓释作用。而在其不良反应研究中对肝癌模型小鼠肝肾功能进行评价，发现于小鼠静脉给予载甲氨蝶呤红细胞后，其丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、血清尿素氮（BUN）及肌酐（Scr）水平均较裸药甲氨蝶呤下降，且接近正常水平，说明载甲氨蝶呤红细胞对肝肾具有保护作用，相对于包载前大大提高了安全性。

3.3 紫杉醇

Harisa等[24]针对红细胞包载紫杉醇进行了研究。该实验通过低渗预膨胀法将紫杉醇包载入红细胞中，包载率达到46.36%，且载紫杉醇红细胞形态、稳定性、渗透脆性均较包载前无明显变化，载药红细胞48 h药物释放率为81%。

3.4 5-杂氮-2′-脱氧胞苷（5-Aza-2-dC）

Cinti等[25]运用红细胞成功包载了5-Aza-2-dC，基于红细胞载体的高效和靶向基础上用病毒刺突融合糖蛋白修饰，并通过荧光染色观察其作用于人子宫颈癌细胞的抗肿瘤作用。实验发现12 h后载药红细胞膜开始与Hela细胞膜黏附，药物释放入肿瘤细胞内，96 h后大部分Hela细胞开始凋亡。该实验还证实了用HA病毒蛋白修饰的载体红细胞能通过与Hela细胞的高效黏附增强药物的生物利用度。

其他被红细胞包载的抗肿瘤药物还有：依托泊苷、阿霉素、道诺霉素、柔红霉素、多柔比星等。

4 小结

自载体红细胞研究至今，其良好的生物相容性、生物可降解性、长循环时间等优势早已被人熟知，并且随着对这些优势和抗肿瘤药物研究的不断深入，目前已包载了50多种物质用于临床研究和应用。在载体红细胞抗肿瘤研究中，人们通过对其进行修饰，比如戊二醛修饰、磁化、变性处理等，提高载体红细胞在抗肿瘤方面的器官靶向性，同时增加载体红细胞的缓释作用，这些处理方法均提高了药物的抗肿瘤作用。虽然载体红细胞的研究有很多重大突破，但是目前除了载L-门冬酰胺酶红细胞已应用于临床治疗急性淋巴细胞白血病外，大部分载体红细胞包载药物的研究均因药物控释不佳等停留在临床前阶段，并没有真正地应用于临床，这也是此研究留下的一点遗憾。因此对载体红细胞载药的研究应着重向临床应用推广，这才是医学研究者以后为之努力的方向。

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江苏省六大人才高峰项目（2011-WS-005）；2011年度南京市医学科技发展计划项目（QYK 11167）#

（corresponding author），e-mail：qianxiaoping211@hotmail.com

（2015-02-15）