体内药物分析学生实验中药物血样测定方法的优选与比较

摘要：本文优选了药学本科生中有关体内药物分析的具体实例，探讨了实验方法的可行性，并对测定方法进行优化与比较。采用蛋白沉淀法进行样品前处理；紫外检测器与荧光检测器同时定量测定，比较两种不同检测方法的抗干扰能力与信号响应强度的差异，优化实验条件。与原先设计的实验相比，本实验可操作性强，血药浓度方法简单、准确。而且可以使学生在复杂样品测定方法选择时有更好的感性认识、提高实验教学效果，强化所学基础知识的实际应用。为适应今后工作打下坚实的基础。

关键词：高效液相色谱法；氧氟沙星；体内药分学生实验

中图分类号：G642.41 文献标志码：A 文章编号：1674-9324（2014）48-0275-03

体内药物分析是一门研究生物机体中药物及其代谢物和内源性物质的质与量的变化规律的分析方法学。体内药物分析直接关系到药物研制、药物临床试验与使用、药物作用机制探讨、药物质量评价等各阶段的工作。它在探求科学用药规律与安全、有效、合理用药、开发新药、保障人类健康方面具有重要作用。

对体内药物进行研究时，要求分析方法的灵敏度、专属性和可靠性的程度均较高，建立有效的分析方法是体内药物分析的首要任务。其次，在新药研究过程中，按照国家新药注册审批有关规定，要提供药物在动物和人体内的药物动力学参数、生物利用度及血浆蛋白结合率等基本数据，这些研究工作要靠体内药物分析来完成。再者，为保证临床用药安全有效，体内药物分析也应为治疗药物监测提供准确的血药浓度测定值，并对血药浓度进行具体分析和合理解释，提供药学情报和信息，参与指导临床合理用药确定最佳剂量、制订治疗方案。

建立准确、可靠的生物样品分析方法是进行体内药物分析的基础。体内样品大都采样量少、待测药物浓度低、干扰物质多，因此体内药物分析的特点是体内样品测定前须经分离与浓集，并且对定量分析方法的灵敏度和专属性要求较高。体内样品分析包括两部分，一部分为前处理方法的选择和优化，包括蛋白沉淀、液液提取、固相萃取等；第二部分为定量测定方法包括色谱法、免疫分析法等，其中高效液相色谱法因其专属性强、准确度好而在体内药物分析中发挥着最为重要的作用。

为培养学生独立思考能力和解决问题的能力，巩固和加强对所学知识的认识，我们将原来体内药物分析实验课程选用的实验“血浆中水杨酸的HPLC测定”改为“血浆中氧氟沙星的HPLC法测定”[1-4]。氧氟沙星具有强的荧光吸收，而水杨酸只有紫外吸收，将水杨酸换成氧氟沙星，同时采用两个检测器采集数据，根据两种检测器中的样品出峰情况，学生可以直观地对检测方法进行专属性和灵敏度的比较，巩固课堂上关于药物结构与分析方法选择的相关知识。为学生今后科研工作提供有益参考，对于提高学生的药学专业素质有着至关重要的作用。

一、实验内容

1.实验药物：氧氟沙星标准品，氧氟沙星胶囊。

2.实验动物：雄性大鼠，体重250g左右，由复旦大学药学院实验动物中心提供。

3.实验方法。①给药方案：按80mg/kg剂量一次性大鼠灌胃氧氟沙星，灌胃后1.5小时取大鼠血样于预加肝素试管中，2500转/分钟离心10分钟，吸取上层血浆于试管中，-18℃冰箱冷冻保存。②仪器条件：日本HITACHI公司L-2000型高效液相色谱仪，含四元泵（L-2130）、柱温箱（L-2300）、自动进样器（L-2200）、二极管阵列检测器（L-2455）和D-2000工作站。色谱分析条件：色谱柱：C18柱，200mm×4.6mm（ID），5m。柱温：30℃。流动相：0.5%三氟乙酸水溶液：甲醇=60：40；紫外检测：检测波长296nm；荧光检测：激发波长296nm，发射波长498nm；流速：1.0mL/min③氧氟沙星标准溶液的配制：精密称取氧氟沙星标准品5.16mg，置于100mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，药物浓度为0.509mg/mL（标准品含量98.6%），作为贮备溶液。精密量取贮备溶液适量，用甲醇稀释成浓度分别为508.8μg/mL、50.88μg/mL和5.09μg/mL的溶液。④血样处理：精密移取血浆0.2ml，置1.5ml塑料离心管内，加入10%高氯酸溶液0.1mL，旋涡2min后，16000rpm离心10min，取上清液20l进样作HPLC分析。外标法定量。

二、实验结果

1.专属性考察。在此色谱条件下，氧氟沙星与血浆中内源性杂质均完全分离，峰形尖锐，其保留时间约为4.2分钟，其他均为内源性杂质。考察了6份不同来源的大鼠血浆，在所建立的HPLC条件下进行分析，典型色谱图如图1～2。其中图1为空白血浆色谱图，图2为含药血浆色谱图，图中a为荧光检测器信号；b为紫外检测器信号。从图中可以看出紫外检测器中杂峰明显偏大，而且在药物信号窗附近有干扰；荧光检测器时血浆中的内源性杂质不干扰并且氧氟沙星的色谱峰远远高于紫外检测器中的响应。

2.荧光检测器检测的标准曲线与线性范围。取若干只1.5mL塑料离心管，各加入空白血浆0.5mL，加入氧氟沙星对照品溶液，使其浓度分别为0.020、0.051、0.102、0.204、0.509、1.018、2.036、5.088和

10.176μg/mL，每个浓度三管，再按“血样预处理”项的方法操作后，作HPLC分析。以样品峰面积（Y），对药物浓度（C，μg/mL）进行线性回归，计算结果为Y=820.5506C-73.2914（r=0.9992，n=9）。线性范围：0.0210μg/ml。

3.精密度。配制高、中、低三个点（0.05、0.5和5μg/mL）的标准血样各6份，于同一天按血样预处理的方法操作后进样20μL，作HPLC分析，计算批内精密度。连续测定三批样品作批间精密度试验。结果为低、中、高浓度的天内精密度RSD分别为5.53%、2.25%及1.17%。批间精密度RSD分别为5.22%、3.28%及1.91%。endprint

4.方法回收率。取大鼠空白血0.5mL若干，分别加入氧氟沙星对照品溶液，使其浓度分别为0.05、0.5和5g/mL，再按“血样预处理”项的方法操作后，作HPLC分析。将药物峰面积代入标准曲线的方程中，计算所得的浓度除以理论浓度，即得方法回收率，结果分别为103.96±4.16%、100.58±1.91%及100.02±1.16%。

5.提取回收率。取大鼠空白血浆0.5ml数份，分别加入氧氟沙星标准溶液使血浆中氧氟沙星的浓度分别为0.05、0.5和5μg/mL，同法用水代替血浆制备三个浓度样品，每个浓度做三份，按血样预处理后作HPLC分析，记录峰面积。计算提取回收率。结果分别为88.75%±1.58、93.92%±6.37及91.70%±2.01。

6.定量限。取大鼠空白血浆0.5mL，精密加入氧氟沙星标准品溶液，使其浓度为0.01μg/mL，再按“血样预处理”项的方法操作后，进样20μL，血样最低定量浓度荧光检测器为0.02μg/mL、紫外检测器为0.2μg/mL。

三、讨论

1.样品预处理方法的选择。本实验的样品预处理方法为沉淀蛋白法，操作极为简单，引入误差小，样品的取用量少。而原先样品预处理方法为有机溶剂提取法，方法操作烦琐，在处理过程中样品容易发生乳化而导致样品损失；另外采用液液提取法血浆样品取用量大，实际操作性差，同时实验成本较高。

2.测定方法的选择。本实验中我们开发了测定大鼠血浆中氧氟沙星的高效液相色谱测定方法，该方法灵敏、专属、准确性高，血药浓度测定准确。选择具有紫外及荧光吸收的药物进行HPLC分离后荧光与紫外同时检测，通过两种检测器检测结果比较，使学生掌握以药物结构为依据进行定量方法选择这一重要思路，为学生今后科研工作提供有益参考。

经本校多个年级本科生的实验教学证明，该实验方法操作性强、实验方法简单直观、测定结果准确，大大提高了学生对教学内容的认识，达到了较好的实验教学目的。

参考文献：

[1]刘芳群，鲁虹.高效液相色谱法测定人血浆中左氧氟沙星的浓度[J].中南药学，2012，10（10）：734-736.

[2]李涛，左氧氟沙星人体血药浓度测定及药代动力学分析[J].吉林医学，2011，32（27）：5725-5726.

[3]郝晓花，蒋晔，谢赞，刘红菊，郝福.RP-HPLC测定血清中氧氟沙星的浓度[J].华西药学杂志，2006，21（2）：192-193.

[4]万慧杰，唐星.氧氟沙星缓释胶囊家犬体内药动学及相对生物利用度[J].中国新药杂志，2006，15（17）：1458-1460.

作者简介：梁建英，女，副教授，硕士生导师，复旦大学药学院，药物分析学教研室。endprint