拉米夫定对乙型肝炎病毒 转染肝癌细胞放射敏感性的影响※

张晶晶 曲 颂 雷 风 叶奕菁 陆小军

拉米夫定对乙型肝炎病毒 转染肝癌细胞放射敏感性的影响※

张晶晶1曲 颂2雷 风1叶奕菁1陆小军1

目的 探讨拉米夫定对乙型肝炎病毒（HBV）转染肝癌细胞放射敏感性的影响。方法 拉米夫定对HBV转染肝癌细胞的抑制效果采用荧光定量PCR检测，拉米夫定对HBV转染肝癌细胞放射敏感性的影响采用平板克隆观察，癌细胞凋亡率采用流式细胞仪检测。结果 HBV病毒抑制率随着拉米夫定的浓度和作用时间增加而变大，拉米夫定和照射均能促进HBV转染肝癌细胞的凋亡，降低乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸（HBV-DNA）的表达水平。结论 拉米夫定能够抑制HBV复制，增强HBV转染肝癌细胞的放射敏感性，可能与增强放射诱导有关。

拉米夫定；乙型肝炎病毒；癌细胞；辐射耐受性

肝细胞癌属于放射敏感肿瘤，目前放射治疗是肝癌最有效的方法，能够提高患者的生活质量[1-3]。拉米夫定属于胞嘧啶核苷衍生物，起效非常快，是当前抑制乙型肝炎病毒（HBV）复制的重要药物，能够抑制脱氧核糖核酸（DNA）的合成[4-5]。为分析拉夫米定的放射增敏效应，现将拉夫米定作用于HBV转染的肝癌细胞系HepG2215细胞中，通过流式细胞仪以及荧光定量 PCR等研究拉米夫定是否具有放射增敏作用，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料及仪器

1.1.1 试验材料 采用 HBV转染的肝癌细胞系HepG2215细胞株分析。细胞培养采用 Solarbio公司生产的DMEM培养基、Hyclone公司生产的胎牛血清、Solarbio公司生产G418、北京全式生物技术有限公司生产胰蛋白酶、Sigma公司生产二甲基亚矾（DMSO）、噻唑蓝溶液（MTT）等。

1.1.2 试验仪器 实验室使用的仪器主要包括苏州净化设备厂产超净工作台、上海跃进医疗器械厂生产电热恒温烘箱、海尔公司产－20 ℃冰箱、微波炉、MJ Research公司产酶联免疫检测仪、珠海黑马医学仪器有限公司产UV-型紫外分析仪。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 HBV转染肝癌细胞用10%胎牛血清及G418 380 μg/ml在DMEM培养基中培养，放置于37 ℃的恒温细胞培养箱中，每隔2个月筛选1次，后续实验操作均采用含10%胎牛血清在DMEM培养基培养。将肝癌细胞放置在紫外灯下照射30 min，向离心管中加入DMEM培养基溶液2 ml，取出细胞，迅速放入电热恒温水槽中，待融化后将细胞悬液放置在离心管中，离心半径3 cm，1 000 r/min，离心5 min取下层沉淀，放置于细胞培养瓶中，瓶口消毒，次日在显微镜下观察细胞形态。取对数生长期细胞，细胞增至80%时次日冻存，滴加1 ml胰酶消化细胞，加入培养液，用血球计数板计算细胞数，离心5 min，加入新鲜配置的细胞冻存液，调整细胞浓度，分装于冻存管内，观察细胞生长情况。取对数期生长的肝癌细胞，细胞计数采用血球计数板，稀释，将细胞浓度调整为5×104个/ml，设置空白凋零孔，不接种细胞，细胞贴壁后从培养中取出放入96孔板中，加入20 μl MTT溶液，用针头去除上清液。

1.2.2 细胞照射 细胞照射剂量分别为0、2、4、6、8 Gy，照射野为10 cm×10 cm，在培养皿中加等效膜，保证照射野剂量均匀。

1.2.3 拉米夫定浓度和作用时间的确定 取对数期肝癌细胞制成单细胞悬液，将细胞接种至培养皿中，加入不同浓度的拉夫米定，浓度分别设定为 0.0、

2.5、5.0、10.0、25.0 μg/ml，药物作用24 h和48 h，提取培养皿上清液加入等量DNA浓缩液，离心去除上清液。在DNA提取液中加入HBV阴性质控品，保存检测数据。

1.2.4 拉夫米定对细胞放射敏感性的影响 采用平板克隆法测定，拉夫米定的浓度设定为10 μg/ml，分为加药照射组、空白对照组、单纯照射组和单纯加药组。单纯照射组、加药照射组采用X线照射细胞，细胞照射后继续培养，观察细胞克隆情况，将细胞克隆数据换算成细胞生存率。按照单击多靶模型公式以最小误差法进行肝癌细胞放射-生存曲线的拟和，根据放射曲线图求得各参数值。

1.2.5 细胞凋亡率变化 采用 0.25%胰蛋白酶消化成单细胞悬液，尽快测定各组细胞凋亡率，重复3次。

1.2.6 RNA表达变化 提取总组细胞RNA，逆转录成DNA，利用Band leader 3.0图像处理软件分析各组细胞HBV-RNA的相对表达水平。

1.3 统计学分析 采用SPSS 22.0统计软件进行分析，计量资料以±s表示，组间比较采用秩和检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞生长状况 用倒置相差显微镜观察细胞呈岛状聚集生长，大小不一，细胞接种2 d后增殖旺盛，呈对数期生长。

2.2 拉米夫定抑制HBV复制的作用 HBV抑制率随着拉米夫定浓度的增加而变大，差异有统计学意义（P＜0.05）；HBV抑制率随着拉米夫定作用时间的延长而增大，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表1 拉米夫定不同浓度时抑制HBV复制 的作用(%,±s)

浓度(μg/ml) 24 h抑制率 48 h抑制率 0.0 0.8±0.2 1.3±0.1 2.5 0.8±0.1 1.4±0.2 5.0 1.2±0.1 2.1±0.4 10.0 1.4±0.3 2.5±0.6 25.0 1.5±0.4 2.9±0.4

2.3 拉米夫定对HBV转染肝癌细胞放射敏感性的影响 加药照射组的D0值、Dq值、N值、SF2值明显低于单纯照射组，SER值＞1，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表2。

表2 两组拉米夫定对HBV转染肝癌细胞放射敏感性的影响

2.4 细胞凋亡率变化 空白对照组细胞凋亡率为（1.3±0.7）%，单纯加药组细胞凋亡率为（11.8± 1.5）%，单纯照射组细胞凋亡率为（16.1±4.4）%，加药照射组细胞凋亡率为（21.9±2.3）%，加药照射组细胞凋亡率明显高于其他各组，差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.5 拉米夫定和照射对HBV-RNA表达的影响 拉米夫定和照射均能降低HBV转染肝癌细胞的RNA表达水平，加药照射组的 RNA相对表达值明显低于其他各组，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表3 4组拉米夫定和照射对HBV-RNA表达的影响

3 讨论

肝细胞癌属于放射敏感肿瘤，主要是由慢性HBV感染所致，当前肝癌的治疗方法主要包括手术治疗、放射治疗等[6]。研究表明，HBV可能通过DNA整合插入宿主基因中导致癌症的出现。拉米夫定属于胞嘧啶核苷衍生物，能够抑制DNA的合成，对癌细胞放射敏感性的影响有着非常现实的意义。

本研究分析了拉米夫定对乙型肝癌细胞放射敏感性的影响，通过荧光定量法检测拉夫米定对DNA的影响，结果表明10 μg/ml拉米夫定作用48 h具有最高的抑制效率。张娟等[7]研究结果也表明，拉米夫定对乙型肝炎相关癌细胞具有放射增敏作用。在以往的研究中对拉米夫定的放射增敏机制的研究非常少，很少推测细胞凋亡与增敏机制的相关性。在本研究中采用流式检测法分析拉米夫定和照射对HBV转染肝癌细胞凋零的影响，结果表明拉米夫定能够抑制HBV转染肝癌细胞的增值。有研究发现，癌细胞生长周期中D1是细胞周期的关键期[8-9]，在本研究中，拉米夫定是否通过降低癌细胞D1的表达来增强HBV转染肝癌细胞的放射敏感性，还需相关的实验验证。

综上所述，拉米夫定能够抑制HBV复制，增强乙型肝炎相关癌细胞的放射敏感性，为临床抗HBV的治疗提供了理论依据，在本研究中未分析拉米夫定对HBV转染肝癌细胞周期的影响，仍需进一步完善。

[1]李井华,黄龙生,张吉翔.拉米夫定治疗失代偿期乙型肝炎肝硬化的疗效观察[J].当代医学,2012,18(19):155-156.

[2]蔡承红,李朝霞,厉景南.抗结核药物联用拉米夫定治疗和护理肺结核并乙肝病毒携带者85例效果[J].中国乡村医药,2014,17(14): 5-6,10.

[3]赵波.拉米夫定联合阿德福韦酯在失代偿期乙型肝炎肝硬化患者中的应用效果[J].河北医药,2014,36(2):187-188.

[4]彭玲珍.拉米夫定对人乙肝病毒相关肝癌细胞放射敏感性的影响及机制研究[D].南昌大学,2012.

[5]李河博,周光耀.恩替卡韦与拉米夫定治疗慢性乙型肝炎疗效比较[J].现代医药卫生,2014(22):3448-3449.

[6]赵紫烟.拉米夫定治疗失代偿期乙肝肝硬化的临床治疗进展[J].当代医学,2011,17(13):65-66.

[7]张娟,陈建宗,张金平,等.黄芪甲甙体外抗乙型肝炎病毒的作用[J].第四军医大学学报,2007,28(24):2291-2293.

[8]李玲玲,华海清,秦叔逵.以毒攻毒法治疗原发性肝癌获长期生存1例[J].中医杂志,2014,55(1):89-90.

[9]刘百舸,陈静.拉米夫定联合阿德福韦酯治疗乙肝抗病毒初治症的疗效观察[J].当代医学,2013,19(11):53-53.

R512.6+2;R735.7

A

1673-5846(2015)05-0031-03

1中山市人民医院肿瘤放疗科，广东中山 528403

2广西医科大学附属肿瘤医院放疗科，广西南宁 530021

中山市科技计划项目（20132A083）

张晶晶（1981-），双博士学位

陆小军（1957-），主任医师。E-mail：L6993@163.com