原发性肝癌患者外周血辅助性T细胞17及白介素17水平的临床意义

雷林瑜，陆鹏，解寒冰，余江涛，李道明

（1.河南省郑州人民医院普通外科，河南 郑州，450003；2.郑州大学第一附属医院病理科，河南 郑州 450052）

·临床论著·

原发性肝癌患者外周血辅助性T细胞17及白介素17水平的临床意义

雷林瑜1，陆鹏1，解寒冰1，余江涛1，李道明2

（1.河南省郑州人民医院普通外科，河南 郑州，450003；2.郑州大学第一附属医院病理科，河南 郑州 450052）

目的观察原发性肝癌（PHC）患者外周血中辅助性T细胞17（Th17）与细胞因子白介素17（IL-17）的分泌水平，探讨Th17细胞及IL-17与PHC病理发展的关系。方法选取PHC患者80例以同期40例健康体检健康者作为对照组，收集两组的外周血后采用流式细胞术检测Th17细胞亚群的比例，ELISA法检测血清中的IL-17水平，RT-PCR检测转录因子RORγT mRNA水平，并分析RORγT表达水平与PHC临床病理学特征的关系。结果PHC患者外周血中Th17占CD4+T细胞比例为（4.09±0.33）%，显著高于对照组（1.38±0.27）%，差异有统计学意义（P＜0.05）；PHC患者外周血中IL-17水平为（57.73±6.21）pg/ml，显著高于对照组（33.98±4.47）pg/ml，差异有统计学意义（P＜0.05）；PHC患者外周血转录因子RORγT mRNA水平显著高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.001）。肝癌组织中RORγT mRNA的表达水平与肝癌组织Edmondson病理分级显著相关（r=0.685，P＜0.05），且外周血中RORγT mRNA表达水平与HCC分化程度显著正相关（r=0.603，P＜0.05）。结论Th17及IL-17及转录因子RORγT mRNA水平在PHC患者外周血表达增加，且RORγT与PHC的病理分级程度明显相关。

肝癌；RORγT；辅助性T细胞17；白介素17

原发性肝癌（primary hepatic carcinoma，PHC）是世界上最常见的5大恶性肿瘤之一，常发生于肝细胞和肝内胆管上皮细胞，其中90%以上为肝细胞性肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）[1]。由于其手术为主的综合治疗效果不理想，近年来，免疫学治疗肝细胞性肝癌越来越受到临床的重视。

初始CD4+T细胞在不同的抗原作用下可以活化分化为不同的细胞亚型，主要包括Th1、Th2、Th17、Treg等细胞群[2]。其中，辅助性T细胞17（T helper cell17，Th17）是一群以分泌白介素17（interleukin 17，IL-17）为主要特征的细胞，它在类风湿性关节炎、炎性肠病、系统性红斑狼疮等疾病中发挥着重要的作用[3-5]。此外，Th17细胞在动脉粥样硬化、移植排斥反应中亦发挥着极其重要的功能[6-7]。然而，Th17及分泌的IL-17与PHC的关系尚少有研究。因此，本研究旨在观察PHC患者Th17细胞及其分泌的因子IL-17的水平，探讨RORγT在PHC患者的病理中可能发挥的功能。

1 材料与方法

1.1 临床资料

选择2010年1月-2013年12月在郑州人民医院确诊为PHC患者80例为肝癌组，选取同期40例健康体检健康者作为对照组。研究组中，男43例，女37例，年龄62～76岁，平均（63.13±7.21）岁；对照组男21例，女19例，年龄59～79岁，平均（62.28± 7.85）岁。两组患者的一般资料如性别、年龄等方面差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。PHC患者术前均未行放射、化疗及射频消融治疗，组织标本经术后病理学证实为肝细胞癌。所有标本于术中离体30 min内取材，经10%福尔马林溶液固定，石蜡包埋、切片备用。PHC组织根据Edmondson标准分级[5]：Ⅰ级16例，Ⅱ级24例，Ⅲ级22例，Ⅳ级18例。

1.2 主要试剂

大鼠抗人CD3e-APC、大鼠抗人CD4-FITC、大鼠抗人IL-17-PE等流式抗体均购自Biolegend公司。破膜固定剂（Fix/Perm Cell Permeabilization Kit）购自上海英骏公司。蛋白质转运抑制剂（Golgi Stop）购自BD公司。淋巴细胞培养用的不完全1640培养液、胎牛血清以及青霉素-链霉素（武汉博士德公司）按照89∶10∶1比例配制成完全1640培养液。RNA提取试剂试剂Trizol购于美国Gibco公司，逆转录试剂盒购自Femantes公司。

1.3 方法

分别于清晨抽取PHC患者以及正常对照组人群的空腹血，按以下方法处理：

1.3.1 流式染色Th17细胞：外周血红细胞裂解后以完全1640培养液调节浓度至1×106细胞/ml。在反应体系中加入0.8μg/ml PMA、40μg/ml离子霉素及1μl/ml Golgistop，置37℃、5%二氧化碳培养箱中培养6 h。然后用3 ml PBS洗1遍并重悬于100μl PBS中，加入CD3e-APC（0.08 mg/ml）和CD4-FITC（0.4 mg/ml）抗体，混匀后置于室温避光孵育20 min。以3 ml PBS洗1遍，加入100μl Fix/Perm A液并于室温避光孵育20 min。离心清洗后加入100μl Fix/Perm B液重悬细胞后，再加入抗IL-17-PE（0.1 mg/ml）抗体，置4℃避光孵育30 min。以PBS缓冲液洗1遍后，以500μl PBS缓冲液重悬细胞后用流式细胞仪（FACS Calibur，美国BD公司）检测。

1.3.2 ELISA及RT-PCR法检测血清中IL-17水平清晨空腹时抽取各实验对象外周静脉血5 ml，加入EDTA抗凝剂，2h内于4℃，4000g，离心20min，离心后提取上层血清备用。IL-17的ELISA试剂盒购自eBioscience公司，检测流程严格按照试剂盒的说明书进行操作。

取约200μl血浆，加入1 ml Trizol（南京生兴公司）充分匀浆后，按照说明书的要求抽提总RNA，所得RNA溶于20μl DEPC处理水。提取的总RNA经紫外分光光度计进行定量。进一步采用Femantes逆转录试剂盒对所得RNA逆转录成cDNA，置于-20℃冰箱冷冻保存备用。采用RT-PCR法检测外周血中转录因子RORγT。PCR反应条件：94℃变性5 min后扩增40个循环，循环参数为：94℃变性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸30 s，最后72℃延伸7 min。RORγT引物序列：F：5'-GCAATGGAAGTGGTGCTG GTT-3'，R：5'-AGGATGCTTTGGCGATGAGTC-3'；内参GAPDH引物序列：F：5'-ATCTGGCACCACACCTT C-3'，R：5'-AGCCAGGTCCAGACGCA-3'。采用ABI公司的7900型号Real-Time PCR仪器进行PC分析，结果采用2-ΔΔCt法进行相对定量分析。

1.4 统计学方法

采用SPSS 17.0软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示，组间比较用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PHC患者与正常人群外周血Th17水平比较

对照组人群中外周血中Th17比例为（1.38± 0.27）%，显著低于PHC患者的（4.09±0.33）%，差异有统计学意义（t=11.57，P=0.000），提示外周血Th17细胞的增加可作为原发性肝癌患者的预测指标。见图1A、1B。

图1 两组人群外周血Th17细胞比较

2.2 PHC患者与正常人群血清中IL-17水平比较

进一步对Th17分泌的IL-17水平进行检测，结果发现，对照组外周血中IL-17水平为（33.98± 4.47）pg/ml，显著低于PHC患者外周血中的（57.73± 6.21）pg/ml，差异有统计学意义（t=21.54，P=0.000），提示IL-17在PHC患者的发病发展中可能发挥重要的作用。见图2。

图2 两组人群外周血中IL-17的表达水平

2.3 PHC患者与正常人群血中转录因子RORγT mRNA水平比较

PHC患者外周血转录因子RORγT mRNA水平（4.43±0.89）显著高于对照组人群（1.23±0.28），差异有统计学意义（t=16.74，P=0.000），表明PHC患者外周血中Th17水平升高可能是由于转录因子RORγT mRNA水平增加所致。见图3。

图3 两组患者外周血中转录因子RORγT mRNA水平

2.4 PHC患者组织及血中转录因子RORγT表达水平与肝癌组织病理分级的相关性

相关分析结果显示肝癌组织中RORγT mRNA表达水平与PHC分化程度正相关（r=0.685，P= 0.02）；外周血中RORγT mRNA表达水平亦与HCC分化程度正相关（r=0.603，P=0.03）。见附表。

附表 PHC组织、血浆中RORγT mRNA表达与HCC分化程度的关系（±s）

附表 PHC组织、血浆中RORγT mRNA表达与HCC分化程度的关系（±s）

HCC分级n肝癌组织血浆Ⅰ162.27±1.262.97±1.42Ⅱ243.29±1.353.75±1.48Ⅲ224.49±1.214.49±1.37Ⅳ186.51±1.175.82±1.61

3 讨论

原发性肝癌是世界上最常见、恶性程度极高的肿瘤之一。研究认为PHC的发病率在世界上排名第5位，死亡率排在第3位，如果患者得不到有效的治疗，生存期一般为3～6个月[8]。肝癌患者体内的细胞免疫功能对控制肝癌的发生和发展有着极其重要的意义[9-10]。Th17细胞是CD4+T细胞中一种重要的亚群，大量的研究表明，Th17在酒精性肝病、非酒精性肝病以及自身免疫性疾病中发挥重要的作用。此外，Th17细胞在肿瘤免疫中的研究亦有报道，在卵巢癌、黑色素瘤患者中Th17细胞显著增加[11-12]，然而，目前关于Th17细胞和肝癌的关系尚少有研究报道。

本研究发现，与正常人群相比较，PHC患者外周血中Th17细胞明显升高，提示PHC患者的肿瘤微环境可能参与影响Th17细胞的分化及功能。ZHANG等[13]的研究结果发现，Th17细胞在肝癌肿瘤组织中的水平显著高于癌旁组织，高水平的Th17细胞是肝癌患者预后差的独立危险因素。此外，肿瘤内的Th17细胞与肿瘤的微血管密度呈正相关，这均提示Th17细胞具有潜在的促进肿瘤进展的功能。IL-17主要由Th17细胞产生，它可以通过与多种细胞表面的IL-17受体结合后激活IL-17信号，从而通过释放多种细胞因子、趋化因子以及炎性介质，参与机体的免疫调节[14]。本研究发现，PHC患者外周血中IL-17明显高于正常人群，表明PHC患者的肿瘤微环境可能通过促进Th17细胞分泌IL-17来发挥生物学功能。大量研究发现，RORγT是促进Th17细胞分化的最主要的转录因子[15]，RORγT的表达依赖于IL-6和TGF-β[16]。本研究结果显示，PHC患者外周血中RORγT明显高于正常人群，提示RORγT在PHC发病中可能起到极大的作用。由于原发性肝癌是一种典型的慢性炎症为主的恶性肿瘤，因此，炎症因子在其进展中作用极其重要。以往有研究表明，STAT3信号的激活以及炎症因子IL-23等是Th17细胞分化的关键性的因素[17-18]。此外，本研究首次发现肝癌组织中转录因子RORγT表达水平与PHC患者组织的分化程度显著正相关，且外周血中RORγT表达水平亦与HCC分化程度显著正相关。王维维等[19]从细胞水平层面上认为肝癌病理与外周血中Th17细胞相关，本研究的结果进一步从分子水平发现了Th17相关的转录因子RORγT与病理的密切联系，从而系统地说明了Th17细胞、相关因子及其转录因子在原发性肝癌的发生、发展中发挥重要的功能。

综上所述，PHC患者外周血Th17细胞及其因子IL-17、转录因子RORγT的水平均明显升高，Th17细胞可能在PHC的发生、发展中有重要作用，对PHC治疗方法的探讨有一定的指导意义。

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（张蕾 编辑）

Clinical significance of T helper 17 cells and related IL-17 level in patients with primary liver cancer

Lin-yu LEI1,Peng LU1,Han-bing XIE1,Jiang-tao YU1,Dao-ming LI2
(1.Department of General Surgery,Zhengzhou People's Hospital,Zhengzhou,Henan 450003,P.R.China;2.Department of Pathology,the First Affiliated Hospital, Zhengzhou University,Zhengzhou,Henan 450052,P.R.China)

【Objective】To observe the T helper 17(Th17)cells and interleukin 17(IL-17)level in primary hepatocarcinoma(PHC),and explore the relationship between Th17/IL-17 and pathological development of PHC.【Methods】A total of 80 cases of PHC were collected as study group and 40 cases of healthy sunjects as control group.Th17 cells in peripheral blood were analyzed by flow cytometry.Serum IL-17 level was detected by ELISA,and the transcription factor ROR γ T mRNA level was detected by RT-PCR.The relationship between PHC ROR γ T and clinicopathological features was also analyzed.【Results】The percentage of Th17 cells in peripheral blood of the PHC patients[(4.09±0.33)%]was significantly higher than that in the controls[(1.38±0.27)%],the difference was statistically significant(P＜0.05).The IL-17 level in the PHC patients[(57.73±6.21)pg/ml]was also significantly higher than that in the controls[(33.98±4.47)pg/ml,P＜0.05].The level of ROR γ T mRNA in peripheral blood of the PHC patients was significantly higher than that of the controls(P＜0.001).ROR γ T mRNA expression in the PHC tissue was significantly correlated with the Edmondson pathological grade(r=0.685,P＜0.05),and ROR γ T mRNA expression in peripheral blood waspositively correlated with the degree of PHC differentiation(r=0.603,P＜0.05).【Conclusions】Th17 cells, IL-17 and ROR γ T mRNA levels are increased in peripheral blood of PHC patients,and ROR γ T mRNA expression is significantly correlated with the pathological grade of PHC,suggesting ROR γ T as latent factor in PHC diagnosis.

hepatocellular carcinoma；ROR γ T；T helper 17 cell；interleukin 17；TGF-β

R735.7

A

1005-8982（2015）30-0040-05

2015-03-05

李道明，E-mail：lidaoming@zzu.edu.cn