甲基莲心碱联合伊马替尼对慢性粒细胞白血病原代细胞Akt/p-Akt蛋白表达的影响

何思润，胡敏，秦群，杨瑞

（中南大学湘雅医院，湖南 长沙 410008）

·临床论著·

甲基莲心碱联合伊马替尼对慢性粒细胞白血病原代细胞Akt/p-Akt蛋白表达的影响

何思润，胡敏，秦群，杨瑞

（中南大学湘雅医院，湖南 长沙 410008）

目的探讨甲基莲心碱（Nef）联合伊马替尼（IM）对慢性粒细胞白血病（CML）原代细胞Akt/p-Akt表达的影响。方法采用Western blot法分别检测Akt/p-Akt蛋白的表达水平。结果Nef（4μmol）、IM（1μmol）单药组与Nef（4μmol）+IM（1μmol）联合用药组，对CML原代细胞Akt蛋白的表达均无影响（P＞0.05），而p-Akt蛋白表达均降低，且联合用药组较单药组蛋白表达更低（P＜0.05）。结论Nef联合伊马替尼能够降低CML原代细胞p-Akt蛋白表达，可能是甲基莲心碱增强伊马替尼对CML原代细胞敏感性的机制之一。

甲基莲心碱；慢性粒细胞白血病原代细胞；p-Akt；Akt

慢性粒细胞白血病（chronicmyelocytic leukemia，CML）是一种多能造血干细胞的恶性骨髓增殖性疾病，Bcr/abl融合基因是CML发病的分子基础，伊马替尼是Bcr/abl的特异性抑制剂[1]。研究发现，甲基莲心碱（neferine，Nef）联合伊马替尼（imatinib，IM）能够增强K562/G01增殖抑制作用[2]。本实验研究甲基莲心碱联合伊马替尼对CML原代细胞Akt/p-Akt的表达影响，从中探讨甲基莲心碱联合伊马替尼对CML原代细胞敏感性影响的可能机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集中南大学湘雅医院门诊2012年10月-2013年2月初诊为慢性粒细胞白血病慢性期患者3例，年龄18～59岁，平均33.75岁；Ph染色体阳性或Bcr/ abl融合基因阳性。

1.2 主要仪器与试剂

伊马替尼（瑞士诺华公司惠赠），甲基莲心碱（华中科技大学药理学实验室惠赠），1640培基（Gibco/BRL），小牛血清（杭州四季青公司），BCA蛋白分析定量试剂盒（江苏碧云天生物技术研究所），蛋白分子质量标准（美国Genview公司），兔抗Akt抗体，兔抗p-Akt（ser473）（美国Cell Signaling Technology公司），5×SDS-蛋白上样缓冲液（江苏碧云天生物技术研究所）。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞培养门诊收集的骨髓标本在3 h内于无菌操作台内以密度梯度离心法进行单个核细胞的提取和分离。调整细胞密度为5×106个/ml，于每孔1 600μl细胞悬液接种于6孔板，置于37℃、5%二氧化碳培养箱中孵育4 h后，按分组加入药物，使终体积为2 000μl，药物终浓度及实验分组如下：CML细胞悬液+400μl无药组；CML细胞悬液+400μl Nef（4μmol）；CML细胞悬液+400μl IM（1μmol）；CML细胞悬液+200μlIM（1μmol）+200μlNef（4μmol）。按上述分组干预细胞后，置37℃、5%二氧化碳培养箱中培养48 h。

1.3.2 抽提蛋白按上述方法处理CML原代细胞经48 h后，每组取1.5 ml，离心弃上清液，经PBS清洗两遍弃上清液，得细胞沉淀，向其中加入100μl RIPA蛋白裂解液，充分吹打后置冰上20 min，4℃，12 000 r/min，离心10 min，吸取上清液，提取蛋白质。

1.3.3 检测Akt蛋白的表达水平提取各组蛋白质，对其进行蛋白定量和变性，行10%SDS-PAGE电泳，转至聚偏二氟乙烯（polyviny-lidene fluoride，PVDF）膜，加入含5%脱脂奶粉的TBST缓冲液封闭；将Akt和p-Akt抗体及内参稀释后，将目的和内参膜分别放入到Akt、p-Akt和内参的一抗工作液中，4℃孵育过夜；洗膜30 min，将洗好的反应膜转至对应的已稀释好的抗兔Akt二抗、抗兔p-Akt抗体及内参工作液中孵育1 h；洗膜30 min。采用ECL试剂盒进行显影（按A∶B按体积比为1∶1充分混合）。

1.4 统计学方法

采用SPSS 18.0统计软件进行数据分析，实验数据以均数±标准差（±s）表示，资料符合正态分布且各组方差齐，直接用随机区组设计资料方差分析，若结果有统计学意义，进一步用LSD-t检验作两两之间比较；若资料不符合正态分布或方差不齐时，用非参数检验的Fridman M检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

将p-Akt和Akt条带灰度与β-actin的灰度比作为待测蛋白的相对表达量。结果显示，Nef（4μmol）组、IM（1μmol）组及Nef（4μmol）+IM（1μ mol）组，对Akt蛋白表达均无影响（P＞0.05），而p-Akt蛋白表达均降低，Nef（4μmol）+IM（1μmol）组较IM（1μmol）组更降低p-Akt蛋白表达，差异有统计学意义（P＜0.05）。见附表。

附表 Nef与IM对CML原代细胞Akt总蛋白和p-Akt蛋白表达的影响（n=3±s）

附表 Nef与IM对CML原代细胞Akt总蛋白和p-Akt蛋白表达的影响（n=3±s）

注：1）与Nef（4μmol）组比较，P＜0.01；2）与IM（1μmol）组比较，P＜0.05

组别Akt/actin灰度比值p-Akt/actin灰度比值对照组0.390±0.0380.346±0.023 Nef（4μmol）0.396±0.0480.319±0.032 IM（1μmol）0.389±0.0380.077±0.0151）Nef（4μmol）+IM（1μmol）0.414±0.0690.040±0.0072）

3 讨论

慢性粒细胞白血病是由9号染色体的ABL基因易位与22号染色体的BCR融合，形成有酪氨酸激酶活性的BCR-ABL融合基因，进而引起慢性粒细胞白血病[3]。伊马替尼是第一代酪氨酸激酶抑制剂，通过与BCR-ABL激酶结合，使蛋白稳定在一个非活化构象而发挥功能[4]。国际研究中心（IRIS）研究干扰素和伊马替尼的临床试验结果显示，伊马替尼对初诊为慢性粒细胞白血病的慢性期患者的疗效优于干扰素和阿糖胞苷，是慢性粒细胞白血病的一线治疗药物[5]。

甲基莲心碱是从睡莲科植物莲成熟种子的绿色胚芽中提取的一种双苄基异喹啉生物碱，具有抗氧化、抗心律失常、抗血小板聚集、扩血管、降压及化疗增敏等药理作用[6]。研究显示，甲基莲心碱在无毒剂量下能增强伊马替尼对K562/G01细胞的增殖抑制作用[2，7]。

Akt是PI3K/AKT/通路中的关键基因，在慢性粒细胞白血病患者中，PI3K/Akt通路被bcr/abl基因持续激活，Akt磷酸化（p-Akt），p-Akt激活下游靶分子，使通道活性增加，影响骨髓基质粘附性，影响细胞增殖以及凋亡，对CML细胞的发生发展起调控作用[8-9]。本研究采用Western blot法检测Akt/p-Akt蛋白的表达水平，探讨甲基莲心碱联合伊马替尼对CML原代细胞影响及可能的增敏机制。实验结果显示，甲基莲心碱联合伊马替尼能降低p-Akt蛋白表达，作者推测，甲基莲心碱可增强伊马替尼对慢性粒细胞白血病原代细胞的敏感性，可能与降低p-Akt蛋白表达有关。本研究采用的病例标本检测还较少，还有待进一步研究。

[1]EIRING AM,KHORASHAD JS,MORLEY K,et al.Advances in the treatment of chronic myeloid leukemia[J].BMC Medicine, 2011,9(99):1-6.

[2]QIN Q,CHEN XP,YANG ZS,et al.Neferine increases STI571 chemosensitivity via inhibition of P-gp expression in STI571-resistant K562 cells[J].Leukemia Lymphoma,2011,52(4):694-700.

[3]DEININGER M,BUCHDUNGER E,DRUKER BJ.The development of imatinib as a therapeutic agent for chronic myeloid leukemia[J].Blood,2005,105(7):2640-2653.

[4]PANJARIAN S,LACOB RE,CHEN SG,et al.Structure and dynamic regulation of Abl kinases[J].Biological Chemistry,2013, 288(8):5443-5450.

[5]OBRIEN SG,GUILHOT F,LARSON RA,et al.Imatinib compared with interferon and low-dose cytarabine for newly diagnosed chronic-phase chronic myeloid leukemia[J].N Engl J Med, 2003,348(11):994-1004.

[6]唐小卿,曹建国.甲基莲心碱的药理作用[J].中国药理学通报, 2004,20(1):8-10.

[7]杨周生,秦群,闵慧,等.甲基莲心碱增强伊马替尼,多柔比星对K562/G01细胞敏感性的研究[J].中南药学,2008,6(3):280-282.

[8]STEELMAN LS,POHNERT SC,SHELTON JG,et al.JAK/STAT, Raf/MEK/ERK/,PI3K/Akt and BCR-ABL in cell cycle progression and leukemogenesis[J].Leukemia,2004,18(2):189-218.

[9]CHANGF,LEEJT,NavolanicPM,etal.Involvementof PI3K/Akt pathw ay in cellcycle progression,apoptosis,and neoplastictransformation:atargetforcancerchemotherapy[J]. Leukemia,2003,17(3):590-603.

（张蕾 编辑）

Effect of Neferine combined with Imatinib on Akt/p-Akt protein expression in primary cells of chronic myelogenous leukemia

Si-run HE,Min HU,Qun QIN,Rui YANG
(Xiangya Hospital,Central South University,Changsha,Hunan 410008,P.R.China)

【Objective】To investigate the effect of a combination of Neferine and Imatinib on Akt/p-Akt protein expression in chronic myelogenous leukemia(CML)primary cells.【Methods】Akt/p-Akt protein expression was detected by Western blot.【Results】Neither Neferine(4 μmol),Imatinib(1 μmol)alone nor their combination had influence on the Akt protein expression in CML primary cells(P＞0.05).On the contrary,p-Akt expression was reduced in the three groups,and even lower in the combination group(P＜0.05).【Conclusions】p-Akt protein expression is reduced by the combination of Neferine and Imatinib,which may be one of the mechanisms of Neferine sensitizing CML primary cells to Imatinib.

Neferine；chronic myelogenous leukemia primary cell；p-Akt；Akt

R557.3

A

1005-8982（2015）30-0037-03

2015-04-09

秦群，Tel：0731-84327918；E-mail：qinqun8087@hotmail.com