NF-κB、Notch-1及Jagged-1在口腔扁平苔藓中的表达及临床意义*

刘铁军，刘健，陈砚凝，许彦枝

（河北医科大学第四医院，河北 石家庄 050011）

·论著·

NF-κB、Notch-1及Jagged-1在口腔扁平苔藓中的表达及临床意义*

刘铁军，刘健，陈砚凝，许彦枝

（河北医科大学第四医院，河北 石家庄 050011）

目的检测NF-κB、Notch-1及Jagged-1在口腔扁平苔藓及正常口腔黏膜组织中的表达，分析三种蛋白间的相关性，探讨Notch-1/NF-κB信号传导系统在口腔扁平苔藓病损形成及发展过程中的作用。方法采用免疫组化方法检测NF-κB、Notch-1及Jagged-1在52例口腔扁平苔藓和30例正常口腔黏膜组织标本中的表达情况，并分析三种蛋白间的相关性。结果口腔扁平苔藓组织中NF-κB、Notch-1及Jagged-1的表达均明显高于正常口腔黏膜组，差异具有统计学意义（P＜0.05）；NF-κB、Notch-1、Jagged-1在口腔扁平苔藓组织中的表达具有显著相关性（P＜0.05）。结论Notch-1/NF-κB信号通路的异常激活对口腔扁平苔藓的发生发展有重要意义。

口腔扁平苔藓；NF-κB；Notch-1；Jagged-1

口腔扁平苔藓（oral lichen planus，OLP）是一种常见的非感染性口腔黏膜疾病，有一定的癌变倾向[1]，该病病因不明，以往研究应用基因芯片技术筛选出的有关OLP的142个差异表达基因及其8条相关通路，其中NF-κB通路与OLP密切相关[2]。NF-κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）为真核转录因子成员，广泛调控多种细胞因子、趋化因子和免疫受体的表达，其活化也参与细胞增殖和凋亡过程。近年来研究发现，Notch信号通路与一些人类肿瘤的发生发展密切相关，Notch-1是Notch基因家族的成员之一，研究分析其功能失调可阻止细胞分化，最终导致未分化的细胞向恶性转化[3]。有实验证实，NF-κB与Notch转导通路之间存在有复杂的交联对话作用，并构成信号转导网络，广泛参与细胞一系列生理及病理反应过程[4]。本研究通过检测口腔扁平苔藓及正常口腔黏膜组织中NF-κB、Notch-1及Jagged-1的表达情况，分析NF-κB与Notch-1、Jagged-1的相关性，探讨Notch-1/NF-κB信号传导系统在口腔扁平苔藓发生、发展过程中的作用。

1 材料与方法

1.1 样本采集

病例资料：选取河北医科大学第四医院口腔科活检或手术切除并经病理证实的52例口腔扁平苔藓及30例正常口腔黏膜组织。标本取出后，立即投入10%中性福尔马林中固定，100%、85%及75%梯度乙醇脱水，二甲苯透明，常规石蜡包埋，连续切片4μm厚，以备染色。所有组织标本均经河北医科大学第四医院病理科确诊。所选病例均未应用过非甾体抗炎药物、未进行过放化疗等治疗。

1.2 主要试剂

NF-κBp65（中杉金桥公司），Notch-1及Jagged-1羊抗人多克隆抗体（SANTA CRUZ公司），P-V法免疫组织化学（免疫组化）检测试剂盒（上海基因公司）。

1.3 免疫组化P-V法

石蜡切片常规脱蜡，水化，自来水冲洗；滴加过氧化物酶阻断试剂，室温下孵育10 min，PBS洗涤3次，每次3 min；在切片上分别加入NF-κB、Notch-1及Jagged-1抗体，4℃孵育过夜；滴加二抗孵育20 min，PBS洗涤3次；显色剂显色；苏木素复染，PBS返蓝，常规乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片保存。以PBS代替一抗作为空白对照，以不加一抗作为阴性对照。抗体稀释度分别为：NF-κB抗体为1∶60 Notch-1抗体为1∶100，Jagged-1抗体为1∶300。

1.4 结果判定

光学显微镜下，随机选取5个高倍视野（× 400），观察肿瘤细胞的胞浆和胞核，结合阳性细胞所占百分比和染色强度进行半定量分析，并根据染色强度按下列标准评定：阴性为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；染色的阳性细胞所占百分比评定：阴性为0分，阳性细胞数≤25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，＞75%为4分。然后根据两项评分相乘之积判断结果：≤1分为阴性（-），2～3分为弱阳性（+），4～5分为中度阳性（++），≥6分为强阳性（+++）。

1.5 统计学方法

应用SPSS 13.0统计分析，各组表达程度的比较用非参数检验方法，相关性采用Spearman相关分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NF-κB的表达情况

NF-κB在正常口腔黏膜组织及OLP组织中均有表达。在正常口腔黏膜组，其阳性着色偶见于基底层细胞的细胞浆；在OLP组，阳性着色密集分布于基底层细胞及固有层T淋巴细胞的胞浆中，偶见细胞核中，见图1。统计学分析显示，NF-κB在OLP中的表达明显高于正常口腔黏膜组（Z=-7.709，P= 0.000），见表1。

2.2 Notch-1的表达情况

Notch-1在正常口腔黏膜组织、OLP组织中均有表达。在正常口腔黏膜组，大多数细胞为阴性，在细胞密集的区域，可见少数的阳性细胞，其阳性着色主要见于细胞浆；在OLP组，其阳性物质呈颗粒状，密集分布于基底层细胞的细胞浆及细胞核，见图2。统计学分析显示，Notch-1在OLP组中的表达明显高于正常口腔黏膜组（Z=-6.528，P=0.000），见表2。

2.3 Jagged-1的表达情况

Jagged-1在正常口腔黏膜组织、OLP组织中均有表达。在正常口腔黏膜组，其阳性着色少量散在分布于基底层细胞的细胞浆及细胞膜；在OLP组，阳性着色增强，其分布特点基本同正常黏膜组织，但较密集，见图3。统计学分析显示，Jagged-1在OLP组中的表达明显高于正常口腔黏膜组（Z=-6.630，P =0.000），见表3。

2.4 口腔黏膜组织中NF-κB、Notch-1、Jagged-1表达相关性分析

在口腔扁平苔藓组中NF-κB与Notch-1的表达明显相关（r=0.333，P=0.016），与Jagged-1的表达明显相关（r=0.284，P=0.041），Notch-1与Jagged-1的表达具有显著相关性（r=0.440，P=0.001），见表4～6。

图1 NF-κB在口腔扁平苔藓和正常口腔黏膜组织中的表达（PV×100）

图2 Notch-1在口腔扁平苔藓和正常口腔黏膜组织中的表达（PV×100）

图3 Jagged-1在口腔扁平苔藓和正常口腔黏膜组织中的表达（PV×100）

表1 NF-κB在口腔扁平苔藓和正常口腔黏膜组织中的表达

表2 Notch-1在口腔扁平苔藓和正常口腔黏膜组织中的表达

表3 Jagged-1在口腔扁平苔藓和正常口腔黏膜组织中的表达

表4 口腔扁平苔藓组织中NF-κB、Notch-1的相关性分析

表5 口腔扁平苔藓组织中NF-κB、Jagged-1的相关性分析

表6 口腔扁平苔藓组织中Notch-1、Jagged-1的相关性分析

3 讨论

NF-κB是一种广泛存在于真核细胞内的基因多向性转录因子，属于Rel家族，因能与免疫球蛋白κ链基因的增强子κB序列（GGGACTTTCC）特异性结合而命名。NF-κB作为细胞内最重要的一种核转录因子，能与多种基因启动子或增强子的κB位点发生特异性结合，启动和调节其基因转录，参与多种细胞活动，发挥其生物学功能，其中最主要的2个功能为调节细胞增殖、凋亡和调节免疫、炎症反应。本研究发现NF-κB蛋白表达主要定位于细胞浆，偶见细胞核中，在基底层细胞和OLP组织固有层的T淋巴细胞中表达。其在OLP组织中的表达明显高于正常口腔黏膜组织。这一结果与SANTORO[5]等研究结果一致，均提示NF-κB与OLP的形成、发展及癌变密切相关。其作用机制有可能是通过对相关细胞因子（如IL-6、TNF-α及ICAM-1等）基因的诱导性调节作用，参与细胞的增殖、分化；或者是通过对凋亡蛋白和抗凋亡蛋白不平衡表达的调节作用；以及与肿瘤抑制蛋白（如p53）的直接作用实现抗凋亡功能。此外，不同的细胞、刺激因素以及同一细胞处于不同的病理生理状态，都影响着NF-κB的活化及其调控基因的转录差异性，NF-κB信号通路的调节是一条十分精细的调节途径。

Notch信号通路是一条高度保守的细胞间转导机制系统，广泛参与各种组织细胞的分化、增殖及凋亡过程，具有重要作用。大量实验已证实Notch信号通路具有致瘤和抑瘤双重作用，对不同肿瘤乃至同一肿瘤的不同时期作用各不相同[6-7]。但关于Notch-1蛋白及其信号途径在OLP的发生发展中是否发挥作用，发挥什么作用的问题，国内外尚无报道。本研究通过免疫组化方法检测Notch-1及其配体Jagged-1在OLP和正常口腔黏膜组织中的表达，旨在初步明确其在OLP发生中可能的作用。实验结果显示：Notch-1蛋白表达主要定位于细胞浆，部分表达于细胞核，而Jagged-1蛋白的表达主要定位于细胞浆及细胞膜。Notch-1、Jagged-1在口腔扁平苔藓组织中的表达显著高于正常口腔黏膜组织，这一结果提示Notch-1与Jagged-1在OLP的发生发展中可能起作用。

NF-κB与Notch-1之间存在一定的交互关系，有证据表明NF-κB家族是Notch信号转导通路的目的基因之一，Notch-1可以通过重组信号结合蛋白JK（RBP-JK）在蛋白-蛋白水平及转录水平调节NF-κB表达下调，导致下游NF-κB的活性减低，最终导致细胞凋亡的发生[8]。本研究中对NF-κB、Notch-1及Jagged-1进行相关性分析，结果显示：在OLP组中，NF-κB与Notch-1、Jagged-1的表达明显相关，Notch-1与其配体Jagged-1的表达具有显著相关性，提示在OLP中Notch-1和NF-κB两条信号通路之间是有关联的。

最近研究发现[9]通过Notch-1信号途径的调节可以部分抑制NF-κB途径的激活，其中IKKa激活能促进视黄酸和甲状腺激素受体沉默中介蛋白（SMRT）在胞浆中的释放，从而减少SMRT与Notch-1基因的靶点联系，抑制肿瘤的生长。WANG等[10]采用RNA干扰技术使Notch-1和Jagged-1的表达下调，抑制前列腺癌细胞的生长，成功诱导癌细胞的凋亡，降低了癌细胞的侵袭浸润能力，并且有效抑制NF-κB p65 DNA结合活性及其下游靶基因VEGF、MMP-9及uPA的表达。

综上所述，Notch-1/NF-κB信号通路的异常激活在口腔扁平苔藓的发生发展过程中相互关联，并有重要作用，这为以Notch-1/NF-κB信号通路为治疗靶点研制开发相关药物提供了理论依据，给OLP的临床治疗开辟了新的思路和方法。

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Expression and clinicopathological significance of NF-κB, Notch-1 and Jagged-1 in oral lichen planus*

Tie-jun LIU,Jian LIU,Yan-ning CHEN,Yan-zhi XU
(The Forth Hospital of Hebei Medical University,Shijiazhuang, Shijiazhuang,Hebei 050011,P.R.China)

【Objective】To investigate the expression of NF-κB,Notch-1 and Jagged-1 in human oral lichen planus and normal oral mucosa tissue,and analyze their correlations.And then we discussed the possible role of Notch-1/NF-κB signaling system in the development and progression of oral lichen planus.【Methods】Immunohistochemical staining was used to measure NF-κB,Notch-1 and Jagged-1 in 52 cases oral lichen planus tissues and 30 cases normal mucosa tissues.And the differences of groups for immunohistochemical staining and the correlation of three proteins were analyzed by statistical methods.【Results】NF-κB,Notch-1 and Jagged-1 expression level in oral lichen planus tissue was higher than that in normal mucosa tissue,which had statistical difference(P＜0.05). NF-κB,Notch-1 and Jagged-1 had the significant correlation in oral lichen planus tissue(P＜0.05).【Conclusion】The unusual activation of Notch-1/NF-κB signaling system play a role in the occurrence and development of OLP．

oral lichen planus;NF-κB;Notch-1;Jagged-1

R781.54

A

1005-8982（2015）31-0026-04

2015-02-10

河北省卫生厅医学科学研究重点课题计划（No：20120126）；河北省科技厅（No：12276104D－41）；河北省中医药管理局（No：2011013）；河北省卫生厅（No：20100125）；国家自然基金课题（No：81273813）

许彦枝，E-mail：xu_yanzhi@163.com，Tel：15831183869