结核性脑膜炎患者血浆和脑脊液中miRNAs含量检测及其临床价值评估

袁秀丽

（山东省临沂市人民医院东医疗区内科三病区，山东 临沂 276034）

·论著·

结核性脑膜炎患者血浆和脑脊液中miRNAs含量检测及其临床价值评估

袁秀丽

（山东省临沂市人民医院东医疗区内科三病区，山东 临沂 276034）

目的评估结核性脑膜炎患者血浆和脑脊液中miRNAs含量检测及其临床价值。方法选择结核性脑膜炎患者58例作为观察组，取同期原发性头痛患者60例作为对照组，检测两组患者的血浆及脑脊液miRNAs含量，IL-6及IFN-γ水平，进一步分析miRNAs含量与IL-6、IFN-γ水平的相关性。结果观察组患者的血浆及脑脊液中miRNA-125b、miRNA-29a、miRNA-155、miRNA-3179a及miRNA-144含量明显高于对照组患者（P＜0.05）；血浆及脑脊液中IL-6、IFN-γ水平低于对照组患者（P＜0.05）；miRNA-125b、miRNA-29a、miRNA-155、miRNA-3179a及miRNA-144表达量与血清IL-6、IFN-γ水平呈负相关（P＜0.05）。结论结核性脑膜炎患者的miRNAs表达异常，一定程度上抑制机体免疫反应、增强病原体毒性，其水平及终端炎症因子水平的测定可以用于患者病情的判断。

结核性脑膜炎；miRNAs；IL-6；IFN-γ

结核性脑膜炎起病隐匿，临床表现不明显，许多患者延误最佳治疗时机导致病情逐步加重，致残率及致死率均较高。以往结核性脑膜炎的诊断主要依靠病原体检测，但是存在检测周期长、灵敏度低等缺陷，关于该病的快速有效的诊断手段探索一直是临床研究的重点。微RNAs（microRNAs，miRNAs）近年来成为一种新型的疾病诊断标志物，关于肺结核患者的体液中miRNAs表达的研究已经开展较多，但是关于结核性脑膜炎患者的体液中miRNAs表达情况及其对疾病诊断的意义报道较少[1]。本次研究主要评估评估结核性脑膜炎患者血浆和脑脊液中miRNAs含量检测及其临床价值。具体汇报如下。

1 资料与方法

1.1 病例选择

研究对象取自2012年11月-2014年11月在本院治疗的头痛患者，其中，结核性脑膜炎患者58例作为观察组，均经结核DNA检测阳性。其中，男性30例，女性28例；年龄33～67岁，平均（46.18± 8.93）岁，体重48～72 kg，平均（64.92±5.33）kg；原发性头痛患者60例作为对照组，体格检查未发现阳性体征，同时脑脊液检测各项指标值均在正常范围内。其中，男性32例，女性28例；年龄35～65岁，平均（47.82±7.81）岁，体重46～73 kg，平均（63.78± 5.29）kg。所有入组患者均签署知情同意书，研究方案经伦理委员会批准通过，两组患者的基线资料差异无统计学意义（P＜0.05），具有可相比。

1.2 研究方法

1.2.1 样本收集抽取所有研究对象的外周静脉血2 ml，同时经腰椎穿刺收集脑脊液3 ml，样本在采集3 h内进行离心，取上清置于无酶冻存管内，-80℃冰箱内冻存备用。

1.2.2 miRNAs含量的PCR检测采用miRNA提取试剂盒抽提结核性脑膜炎患者血浆和脑脊液的总miRNA，使用加尾反转录试剂盒将miRNA反转录为对应的cDNA；取cDNA标本进行PCR扩增，正向miRNA-125b、miRNA-29a、miRNA-155、miRNA-3179a及miRNA-144引物及反向通用引物均由天根公司提供，以U6为内参照对miRNA-21的含量进行半定量分析。

1.2.3 ELISA检测将样本取出4℃冰箱内融化，采用酶联免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）测定其中白介素-6（interleukin-6，IL-6）、干扰素-γ（IFN-γ）水平，具体操作步骤及注意事项按照说明书进行。

1.3 统计学方法

采用SPSS 20.0软件对数据进行统计学分析，两组间计量资料采用t检验，相关性分析采用一元线性回归，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血浆miRNA水平

观察组患者的血浆miRNA-125b、miRNA-29a、miRNA-155、miRNA-3179a及miRNA-144表达量明显高于对照组患者（P＜0.05），见表1。

表1 两组患者的血浆miRNA水平比较

2.2 脑脊液miRNA水平

观察组患者的脑脊液miRNA-125b、miRNA-29a、miRNA-155、miRNA-3179a及miRNA-144表达量明显高于对照组患者（P＜0.05），见表2。

表2 两组患者的脑脊液miRNA水平比较

2.3 血浆及脑脊液炎症因子水平

观察组患者的血浆及脑脊液IL-6、IFN-γ水平均显著高于对照组患者（P＜0.05），见表3。

2.4 miRNA表达与炎症因子水平的相关性

经一元回归分析，观察组患者的miRNA-125b、miRNA-29a、miRNA-155、miRNA-3179a及miRNA-144表达量与血清IL-6和IFN-γ水平呈负相关（P＜0.05），见表4。

表3 两组患者的血浆及脑脊液炎症因子水平比较（pg/ml±s）

表3 两组患者的血浆及脑脊液炎症因子水平比较（pg/ml±s）

组别IL-6IFN-γ血浆血浆脑脊液观察组93.66±10.53 78.26±9.2727.95±2.1511.67±1.72对照组9.17±0.756.35±0.5310.72±0.853.72±0.51 t值10.2411.827.098.18 P值0.0100.0090.0190.015脑脊液

表4 miRNA表达与炎症因子水平的相关性

3 讨论

结核病是一个世界性的重大挑战，据统计目前全球每年新增活动性结核病患者约800万，并有约140万人死于该病。结核分枝杆菌感染的具体分子机制目前尚未阐明，许多耐药及泛耐药结核分枝杆菌的出现更是给世界卫生安全带来巨大威胁。microRNA（miRNA）是一类在转录后水平对基因表达起调控作用的单链非编码RNA，长度为19～22个核苷酸，已经有研究证实miRNA在细胞的死亡、增殖、癌变等环节均发挥重要作用，miRNA表达失调与多种疾病发生包括病毒感染、肺部疾病、肿瘤等等密切相关[2]。关于miRNA与结核病之间的相关关系已经受到广泛关注，miRNA芯片技术首次揭示了miRNA与肺结核的直接相关关系；HARAPAN[3]的研究表明活动性肺结核患者的痰液中存在miRNA的高表达，故有学者提出可以将miRNA作为结核病诊断的标志物以及治疗的靶点。

目前的研究揭示miRNA可以参与免疫细胞的成熟分化及活化，其通过选择性的表达、干扰甚至抑制靶基因mRNA，最终发挥调控免疫反应、免疫应答等作用。柴璐璐[4]在对活动性肺结核及健康人群的血清miRNA-155表达量进行对比后发现，肺结核患者的miRNA-155表达量增加约4倍，提示miRNA-155可能是活动性肺结核的潜在诊断标志。miRNA-29a是新近发现的与多种疾病发生关系密切的小分子RNA家族，其靶基因主要是细胞外基质及迁移蛋白，可以抑制多种胶原蛋白的表达，由于胶原蛋白的异常聚集是纤维化的基础，故miRNA-29a在抗纤维化中发挥重要作用。同时miRNA是T细胞因子或者淋巴样增强因子的负调控因子，可以通过靶向降解IFN-γ降低机体对病原体的免疫应答，通过目标基因IFN-γ来控制结核病的先天性及适应性免疫应答[5]。有研究显示miRNA-144在结核病患者中表达量大增，其可以抑制TNF-α、IFN-γ产生以及T细胞增殖，进一步抵抗结合感染过程中机体的免疫力。miRNA-155时结核杆菌介导巨噬细胞凋亡的必须物质，有研究证实在敲除miRNA-155的大鼠中，结核分枝杆菌疫苗诱导的感染细胞凋亡受到抑制。miRNA-3179a也被认为是结核性脑膜炎的标志性miRNA，其水平高低与疾病严重程度密切相关[6]。上述研究结果显示：观察组患者的血浆及脑脊液中，miRNA-125b、miRNA-29a、miRNA-155、miRNA-3179a和miRNA-144表达量明显高于对照组患者（P＜0.05），提示上述miRNA可以成为诊断结核性脑膜炎的特异性指标。

在结核分枝杆菌感染患者中，诸多miRNA表达量的上调伴随着TNF-α、IFN-γ及IL-6等炎症因子水平的分泌量改变，在本次研究的结果显示：观察组患者的血浆及脑脊液IL-6、IFN-γ水平均显著高于对照组患者（P＜0.05），提示结核分枝杆菌感染患者的miRNA-125b、miRNA-29a、miRNA-155、miRNA-3179a及miRNA-144高表达可以阻断炎症介质表达，使结核分枝杆菌颠覆宿主免疫并增加其毒力，进一步加重病情并增加治疗难度[7]。在进一步对miRNA与炎症介质水平的相关性进行分析后得出结果：观察组患者的miRNA-125b、miRNA-29a、miRNA-155、miRNA-3179a及miRNA-144表达量与血清IL-6和IFN-γ水平呈负相关（P＜0.05），证实miRNA在结核分枝杆菌感染患者中通过参与介导免疫反应并影响炎症反应来发挥对疾病转归的影响[8]。

综上所述，笔者认为，结核性脑膜炎患者的血浆及脑脊液中miRNAs表达异常，一定程度上抑制机体免疫反应、增强病原体毒性，其水平及终端炎症因子水平的测定可以用于患者病情的判断及治疗过程的指导。

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[3]HARAPANH,FITRAF,ICHSANI,et al.The roles of microRNAs on tuberculosis infection:meaning or myth[J].Tuberculosis(Edinb), 2013,93(6):596-605.

[4]柴璐璐,田宋新,袁俐,等.miR-125b、miR-29a和miR-155-5p作为诊断结核性脑膜炎生物标志的研究[J].天津医药,2015,43(6): 674-678.

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Detection of mirnascontentin plasma and cerebrospinal fluidin patients with tuberculous meningitis and its clinical value evaluation

Xiu-li YUAN
(Department of Inner Medicine,East Medical District of Linyi People's Hospital, Linyi,Shandong 276034,P.R.China)

【Objective】To evaluate miRNAs content in plasma and cerebrospinal fluid in patients with tuberculous meningitis and its clinical value.【Method】58 cases of patients with tuberculous meningitis were enrolled as observation group,60 cases patients with primary headache at same period were enrolled as control group.Then miRNAs,IL-6 and IFN-γcontents in plasma and cerebrospinal fluid were detected and the correlation of miRNAs content with IL-6,IFN-γ contents was further analyzed.【Results】miRNA-125b,miRNA-29a, miRNA-155,miRNA-3179a,miRNA-144 contents in plasma and cerebrospinal fluid of observation group were significantly higher than control group(P＜0.05);IL-6,IFN-γ levels in plasma and cerebrospinal fluid were higher than control group(P＜0.05);miRNA-125b,miRNA-29a,miRNA-155,miRNA-3179a,miRNA-144 contents were negatively correlated with serum IL-6,IFN-γ levels(P＜0.05).【Conclusion】miRNAs expression in tuberculous meningitis patients are abnormal and can inhibit immune response,enhance pathogen toxicity at some extent; determination of their level and terminal inflammatory factors levels of can be used for the judgment of disease.

tuberculous meningitis;miRNAs;IL-6;IFN-γ

R529.3

A

1005-8982（2015）31-0022-04

2015-03-21