microRNA181b在老年肝细胞癌中的表达水平及其对癌细胞迁移的影响

夏云展，解寒冰，孙德利，李琼

（河南省郑州人民医院1.普通外科，2.神经内科，河南 郑州 450000）

·论著·

microRNA181b在老年肝细胞癌中的表达水平及其对癌细胞迁移的影响

夏云展1，解寒冰1，孙德利1，李琼2

（河南省郑州人民医院1.普通外科，2.神经内科，河南 郑州 450000）

目的探讨microRNA-181b在老年肝细胞癌（HCC）组织以及患者血浆中的表达水平以及对肝癌细胞迁移的影响。方法选取该院40例HCC患者为研究组，40例同期来该院体检的人群为对照组，采用实时荧光定量RT-PCR法检测老年肝细胞癌组织及对应癌旁组织中以及患者和正常人群血浆中microRNA-181b表达水平；对人肝癌细胞SMMC-7721干扰microRNA-181b后，采用transwell法观察其侵袭水平；并采用RT-PCR以及Western blot检测了SMMC-7721细胞中CXCR4的mRNA及蛋白水平。结果microRNA-181b在肝细胞癌组织中的表达水平显著高于对应癌旁组织，差异有统计学意义（P＜0.05）；microRNA-181b在肝癌患者血浆中的表达水平显著高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。Spearman相关分析显示，microRNA-181b在肝细胞癌组织及血浆中表达与肝癌的分化程度均呈显著正相关（r=0.572，P＜0.05；r= 0.616，P＜0.05）；而肝癌癌旁组织中microRNA-181b表达与肝癌分化程度无显著相关（r=0.216，P＞0.05）。干扰microRNA-181b的SMMC-7721细胞迁移能力显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；且干扰microRNA-181b的SMMC-7721细胞CXCR4的mRNA及蛋白水平降低。结论microRNA-181b在老年肝细胞癌组织中高表达，并且与肝癌细胞的分化程度关系密切，microRNA-181b可能通过影响CXCR4来促进肝癌细胞的迁移。

microRNA-181b；原发性肝细胞癌；迁移；CXCR4

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC），简称肝癌，是恶性程度最高的肿瘤之一，位居全球恶性肿瘤发病率的第5位、死因的第3位，全世界每年大约有100万人死于肝癌，其中老年人是高发人群[1]。然而目前为止，肝癌的发病机制尚未完全明确，人们普遍认为癌基因的激活或者是抑癌基因的异常失活是导致肝癌发生的主要原因。MicroRNA（miRNA）是一类新近发现的长度约为22个核昔酸的非编码单链小分子RNA。随着对miRNA的深入研究发现，其异常表达与肝癌的发生发展有着极其密切的联系[2-4]。microRNA-181b是较早发现的的人类miRNA之一，有研究认为microRNA-181b卵巢癌患者中高表达，且能够促进细胞的生长和侵袭[5]，而microRNA-181b在非小细胞肺癌患者中低表达[6]。然而，目前为止，microRNA-181b在肝癌患者的表达高低极其对肝癌细胞潜在的功能的研究尚少报道。本研究对比了microRNA-181b在老年肝细胞癌及对应癌旁组织中的表达，分析其在肝细胞癌中的表达水平及其与临床病理特征的联系，并探讨其对肝细胞癌侵袭极其机制的影响。

1 资料与方法

1.1 临床资料

所有组织来源于2012年8月-2014年2月期间来本院就医的老年患者的手术切除标本。其中，研究组中共40例。其中，男18例，女22例；年龄61～75岁，平均（64.12±8.18）岁。术前均未经任何介入或化疗等任何处理，所有患者均接受了肝癌根治性切除手术处理，所有组织标本经术后病理学证实为肝细胞癌，分别取肝癌及对应癌旁组织待用。对照组为同期健康体检人群40例。其中，男19例，女21例；年龄60～73岁，平均（65.21±7.98）岁。肝癌的组织于术中离体30 min内取材，经10%福尔马林溶液固定，石蜡包埋、切片备用。HCC组织根据Edmondson标准分级：Ⅰ级6例；Ⅱ级11例；Ⅲ级13例；Ⅳ级10例。

1.2 主要试剂

RNA提取试剂盒Trizol购于Gibco公司，逆转录试剂盒购于美国Femantes公司，DNA Marker、 PCR试剂盒、焦碳酸二乙脂（DEPC）均购于生兴生化科技（南京）有限公司，microRNA-181b的抑制物及U6内参的引物由广州锐博生物科技有限公司设计合成。

1.3 组织以及血浆标本总RNA提取及逆转录反应

肝细胞癌患者手术中取肝癌及对应癌旁组织。此外，清晨空腹时抽取肝癌患者及正常人群的外周静脉血5 ml，加入EDTA抗凝剂，2 h内于4℃下高速离心4 000 g，5 min。离心后提取上层血浆放入-80℃保存备用。

取约150 mg组织或200 ml血浆，加入1 ml Trizol，充分匀浆，抽提总RNA，所得RNA溶于25 ml的DEPC水中。提取的总RNA经紫外分光光度计进行定量及检测纯度。进一步用Femantes逆转录试剂盒进行逆转录，cDNA产物-20℃保存备用。PCR反应条件：95℃变性20 s，然后60℃20 s和70℃1 s进行40个循环。

1.4 细胞转染

采用脂质体2000（美国Invitrogen公司）对人的肝癌细胞SMMC-7721中microRNA-181b低表达，于48 h候检测其干扰效率。

1.5 细胞培养及迁移实验

改良型RPMI1640培养基购自HyClone公司，胎牛血清（FBS）购自美国GIBCO公司，人肝癌细胞系SMMC-7721购自于中国科学院生物化学与细胞生物学研究所。SMMC-7721培养于含100 ml/L的胎牛血清的改良型RPMI1640培养基中，置于37℃，50 ml/L的CO2细胞培养箱中培养。稳定传代3代后，取对数生长期细胞进行实验，调整肝癌细胞密度至3×l05个/ml，按0.1 ml/孔加入到transwell小室的上层，小室下层加入1 ml的含有10%血清的培养液。培养24 h时间后，对己迁移至小室下层的细胞进行计数（随机选取5个视野）。

1.6 免疫印迹检测蛋白水平

收集SMMC-7721细胞，加入1×SDS细胞裂解液，进行SDS-PAGE电泳，100 V电压转膜10 min，37℃封闭90 min，加兔抗人的CXCR4（Biolegend）4℃孵育过夜后，HRP标记的小鼠抗兔二抗（南京生兴生物）（1∶1 000稀释）37℃孵育30 min，ECL发光检测。内参蛋白选用sigma公司的抗人-actin（1∶3 000稀释）。

1.7 统计学方法

统计作图用GraphPad Prism 4.0软件，采用SPSS 19.0软件进行统计分析。两组间差异比较采用Student’st检验，两变量参数相关分析采用Pearson相关性分析，P＜0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肝细胞癌组织及对应癌旁组织中microRNA-181b mRNA的表达水平

与癌旁组织比较，microRNA-181b在肝癌组织中mRNA的表达水平显著增高，差异有统计学意义（t=13.77，P＜0.05），以上结果提示高表达的microRNA-181b在原发性肝细胞性肝癌的发生发展中可能发挥重要的调节功能。见表1。

表1 肝癌及对应癌旁组织中microRNA-181bmRNA的表达水平

2.2 肝细胞癌患者血浆中microRNA-181b mRNA的表达水平

microRNA-181b在肝细胞癌患者血浆中mRNA表达水平显著高于正常人群，差异有统计学意义（t= 15.63，P＜0.05），进一步提示了肝细胞癌患者血浆中高表达microRNA-181b与肝癌的进展有着密切的联系。

2.3 肝细胞癌组织及血浆中microRNA-181b表达水平与肝癌组织病理分级的相关性

相关分析结果显示肝癌组织中microRNA-181b mRNA表达水平与肝癌的分化程度显著正相关（r= 0.591，P＜0.05）（表3），且血浆中microRNA-181b mRNA表达水平与肝癌组织的分化程度显著正相关（r=0.637，P＜0.05）（表3），提示了肝细胞癌的分化愈差，microRNA-181b表达愈强。而肝癌患者癌旁组织中microRNA-181b mRNA表达与肝癌的分化程度未见显著相关（r=0.253，P＞0.05）（表3）。

表2 肝癌患者及正常人群血浆中microRNA-181bmRNA的表达

表3 microRNA-181b mRNA表达强度与肝细胞癌分化程度的关系

图1 低表达microRNA-181b对肝癌细胞侵袭的影响

2.4 低表达microRNA-181b对肝癌细胞侵袭功能的影响

SMMC-7721细胞转染microRNA-181b抑制物后，microRNA-181b水平显著降低（图1A），说明低表达效果成功。与对照组比较，SMMC-7721细胞转染microRNA-181b抑制物后，transwell小室下层细胞数量显著减少（图1B），差异具有统计学意义（P＜0.05），提示了microRNA-181b具有促进肝癌的癌细胞侵袭能力。

2.5 干扰microRNA-181b对肝癌细胞CXCR4的mRNA和蛋白表达影响

为了探讨microRNA-181b对于SMMC-7721细胞侵袭影响的机制，我们检测干扰microRNA-181b基因后肝癌细胞的CXCR4的水平。结果发现，与对照组比较，干扰microRNA-181b的肝癌细胞表达CXCR4的mRNA（2A）和蛋白（2B）水平均显著降低，提示了microRNA-181b可能是通过促进肝癌细胞CXCR4的表达来影响癌细胞的侵袭能力。

图2 低表达microRNA-181b对肝癌细胞迁徙基因CXCR4水平影响

3 讨论

肝癌是世界上比较常见的一种恶性肿瘤，它的诊断和治疗一直都是临床上的难题之一。目前认为，原发性肝癌的发生及发展是一个涉及到多基因、多通路、多步骤的复杂过程[7]。因此，寻找到肝癌特异性的诊断靶点成为人们感兴趣的科学问题。目前，一般认为导致肝癌发生的主要原因为抑癌基因的异常失活或者致癌基因的激活[8]。近年来，表观遗传学及其对于恶性肿瘤的调控机制越来越多的被人们进行深入的研究，这对寻找到肿瘤发生发展的关键表观遗传分子，为癌症的早期诊断和治疗提供重要的参考依据。

microRNA作为一种在转录水平调节基因表达的约22个核苷酸大小的小分子RNA，广泛的存在于组织、血浆或血清以及其他体液中，且在体内表达比较稳定。近年来，肿瘤的表观遗传学调控和microRNA分子的调控越来越受到关注。microRNA在多种恶性肿瘤的发生、发展以及预后中具有及其重要的作用：既具有抑癌基因又具有癌基因的特性，其可对一系列重要的抑癌或者促癌基因的起着重要的调控作用[9-13]。

本研究检测microRNA-181b在老年肝癌患者癌组织及对应癌旁组织中的表达，结果发现，肝癌组织中microRNA-181b的表达水平均高于对应的癌旁组织，且与肝癌Edmonson分级显著正相关；此外，肝癌患者血浆中microRNA-181b表达高于正常人群，且与肝癌的临床分期显著正相关，这些结果均说明了microRNA-181b在肝癌患者癌组织以及血浆中的表达水平可能与肝癌发生发展有密切的联系。MENG等[14]学者在分析胰腺癌组织时发现microRNA-181b较正常对照组显著上调，且发现microRNA-181b能够促进癌细胞的增殖，这与本研究基本一致。

趋化因子受体4（CXCR4）是CXC趋化因子亚家族中一类重要的受体，其在肿瘤中发挥多种作用，特别是与肿瘤细胞的迁移等密切相关[15]。为了探索microRNA-181b影响肝癌细胞的迁移机制，笔者检测了低表达microRNA-181b的肝细胞中CXCR4的表达，结果发现，干扰microRNA-181b的肝癌细胞表达CXCR4的mRNA和蛋白水平均降低，从而提示microRNA-181b通过增加肝癌细胞表达CXCR4来促进肝癌细胞的迁移。分析其机制可能是CXCR4通过增加可使细胞肌动蛋白丝聚合，形成伪足，引起定向迁移、侵袭，利于肿瘤生长。这与Nikzaban, Mehrnoush等认为在胃癌细胞中CXCR4表达水平与胃癌侵袭和浸润密切相关的结果一致[16]。

综上所述，microRNA-181b在肝癌的发生、发展中起着重要的作用，老年肝癌患者癌组织以及血浆中microRNA-181b的检测对于对患者临床个体化治疗以及预后可能具有一定的指导意义。

参考文献：

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Expression of microRNA181b in primary hepatocellular carcinoma in the elderly and the effects of cancer cell migration

Yun-zhan XIA1,Han-bing XIE1,De-li SUN1,Qiong LI2
(1.Department of General Surgery;2.Department of Neurology,Zhengzhou People's Hospital, Zhengzhou,Henan 450003,P.R.China)

【Objective】To investigate the expression of microRNA-181b in primary HCC tissue and plasma of patients as well as migration of hepatoma cells.【Methods】40 cases of primary HCC patients in our hospital as the study group,40 healthy volunteers were used as control group,we used RT-PCR to detect the expression of microRNA-181b in liver cancer and adjacent cancer tissues.After SMMC-7721 interference microRNA-181b,invasion levels were observed using transwell law;and detect the mRNA and protein levels of CXCR4 by RT-PCR and Western blot.【Results】the expression of microRNA-181b in primary HCC tissues was significantly higher than the corresponding adjacent tissues,the difference was statistically significant(P＜0.05);expression of microRNA-181b in primary liver cancer patients was significantly higher in the plasma,the difference was statistically significant(P＜0.05).The expression of microRNA-181b in primary HCC tissue and plasma and liver cancer were significantly positively correlated by Spearman correlation analysis(r=0.572,P＜0.05;r=0.616,P＜0.05).The mRNA and pro－tein levels of CXCR4 were reduced after interference of microRNA-181b in SMMC-7721 cells.【Conclusion】the expressions of microRNA-181b in elderly primary HCC are increased and closely related to the degree of differentiation,microRNA-181b may be to facilitate the migration of liver cancer cells by affecting CXCR4.

microRNA-181b;primary hepatocellular carcinoma;migration;CXCR4

1005-8982（2015）31-0017-05

R735.7

A

2015-06-17